附录基因工程操作中常用的溶液和缓冲液.docx

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附录基因工程操作中常用的溶液和缓冲液

附录一分子生物学实验中常用的溶液和缓冲液

一、酸、碱和盐溶液的配制

盐酸（HCl，分子量36.5，重量百分比36%），1mol/L

按以下顺序混合：

912.5mLH2O；87.5mL浓盐酸。

盐酸（HCl，分子量36.5，重量百分比36%），0.25N/L

按以下顺序混合：

978.4mLH2O；21.6mL浓盐酸。

硫酸（H2SO4，分子量98.07，重量百分比96%），1mol/L

按以下顺序混合：

944.8mLH2O；55.6mL浓硫酸。

硝酸（HNO3，分子量63.02，重量百分比71%），1mol/L

按以下顺序混合：

937.5mLH2O；62.5mL硝酸

冰醋酸（CH3COOH，分子量60.05，重量百分比99.5%），1mol/L

按以下顺序混合：

942.5mLH2O；57.5mL冰醋酸。

乙酸（CH3COOH，分子量60.5，重量百分比36%），1mol/L

按以下顺序混合：

840.5mLH2O；159.5mL乙酸。

甲酸（HCOOH，分子量46.02，重量百分比90%），1mol/L

按以下顺序混合：

957.3mLH2O；42.7mL甲酸。

高氯酸（HClO4，分子量100.5，重量百分比70%），1mol/L

按以下顺序混合：

914.5mLH2O；85.5mL高氯酸。

氢氧化钾（KOH，分子量56.1），1mol/L

56.0gKOH溶解于1LH2O中。

氢氧化钠（NaOH，分子量40.0），1mol/L

将40.0gNaOH溶解于450mLH2O中，补加H2O至1L。

氢氧化钠（NaOH，分子量40.0），10mol/L

将400gNaOH溶于450mL水中，补加H2O至1L。

氨水（NH4OH，分子量35.0，重量百分比25%），1mol/L

按以下顺序混合：

924.9mLH2O；75.1mL氨水。

尿素（CH4N2O，分子量60.06），8mol/L

分批将480.5g尿素溶解在600mL蒸馏水中，加H2O定容只至1L，过滤灭菌。

氯化钠（NaCl，分子量58.5），5mol/L

将292.5gNaCl溶于450mLH2O中，补加H2O至1L。

氯化钾（KCl，分子量74.5），1mol/L

将74.5gKCl溶于450mLH2O中，补加H2O定容至1L。

氯化镁（MgCl2，分子量203.3），1mol/L

将203.3gMgCl2·6H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L，高压灭菌。

硫酸镁（MgSO4，分子量246.5），1mol/L

将246.5gMgSO4·7H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L。

氯化钙（CaCl2，分子量147.0或219.1），1mol/L

将147.0gCaCl2·2H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L，

或将219.1gCaCl2·6H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L。

二、各种常见缓冲液和平衡盐的配制

10%SDS（十二烷基硫酸钠盐）：

称取100gSDS溶解在800mL水中，置68℃水浴中溶解，加数滴浓盐酸调pH到7.2，定容到1000mL，不需要消毒。

禽血DNA提取裂解液：

2mol/L尿素

100mmol/LTris·HCl（pH8.0）

1%SDS

100mmol/LEDTA

现配现用，无需灭菌。

配制方法：

600mL蒸馏水中，顺序加入120.12g尿素，待溶解后加入100mL1mol/LTris（pH8.0），溶解后加入37.2gNa2EDTA·2H2O，溶解后缓缓加入20%SDS50mL，定容至1000mL。

细菌DNA提取裂解液Ⅰ：

25mmol/LTris·HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），50mmol/L葡萄糖，使用前加溶菌酶（2mg/mL）。

细菌DNA提取裂解液Ⅱ（碱-1%SDS）：

1%（W/V）SDS溶解在0.2mol/LNaOH中。

酚（phenol）：

（1）现在有商品酚可直接购买，但是要注意酚的pH值。

（2）酚的纯化和配制（提取核酸用的酚溶液）：

如果购的酚不纯，例如市售酚含有杂质，常呈粉色或淡黄色，需要重蒸二次：

用前从冰箱中取出，在68℃水浴锅中溶解结晶酚，160℃左右蒸馏后，冷却至0℃，加入8-羟基喹啉（100g酚加0.1g8-羟基喹啉），酚变为黄色，8-羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8-羟基喹啉的酚用等体积0.5mol/LTris-Cl（pH8.0）磁力搅拌器搅拌20min，约半小时后两相完全分开，用真空抽液器尽可能吸去上层水相，再加入等体积的0.1mol/LTris（pH8.0）至酚中，搅拌20min，再吸去上层水相，反复数次，至酚相pH值大于7.8，加入0.2%β-巯基乙醇和0.1mol/LTris（pH8.0）分装在棕色瓶中，此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存1个月，纯化和配制酚溶液都要戴手套，以免损伤皮肤。

酚—氯仿—异戊醇：

酚、氯仿和异戊醇按25∶24∶1（V/V）混合而成，加终浓度为0.1%的8-羟基喹啉，上面覆盖一层1cm厚的0.1mol/LTris（pH8.0），分成几份储存于-20℃，超过6个月则废弃。

它用来除去核酸中的蛋白质，异戊醇能消泡沫，有利于水相和有机相分开，氯仿—异戊醇混合液密闭瓶中保存。

Tris-Cl[Tris（三羟甲基氨基甲烷）]，1mol/L

在800mL水中溶解121.1gTris，常温下用浓盐酸调至所需的pH值，常用pH7.4，或pH8.0，混匀后加水定容至1L，高压灭菌。

要获得所需的某一特定pH的0.1mol/LTris·HCl缓冲液的配制，可通过将一定数量的0.1mol/LHCl和100mL0.1mol/LTris溶液混合，如下表附－1所示：

表附－1特定pH的0.1mol/LTris·HCl缓冲液的配制所需的0.1mol/LHCl的毫升数

pH（25℃）

1.1mol/L

HCl（mL）

pH（25℃）

0.1mol/L

HCl（mL）

pH（25℃）

0.1mol/L

HCl（mL）

7.2

89.4

7.8

69.0

8.4

34.4

7.3

86.8

7.9

64.0

8.5

29.4

7.4

84.0

8.0

58.4

8.6

24.8

7.5

80.6

8.1

52.4

8.7

20.6

7.6

77.0

8.2

45.8

8.8

17.0

7.7

73.2

8.3

39.8

8.9

14.0

注意：

Tris缓冲液的pH值随温度变化较大，每1℃可引起大约0.028pH单位的变化。

Tris缓冲液的pH值应调校至待使用温度下的pH值。

因为Tris的pKa值为8.08，因此Tris不应该在大约pH7.2以下和pH9.0以上用作缓冲液。

Tris·HCl，pH6.8,4×：

在40mLH2O中溶解6.05gTris（0.5mol/L），用1mol/LHCl调至pH6.8，补加H2O至整体积100mL，用0.45µm滤膜过滤溶液后于4℃可保存1个月。

Tris•HCl，pH8.8,8×：

在300mLH2O中溶解182gTris（3mol/L），用1mol/LHCl调至pH8.8，补加H2O至整体积500mL，用0.45µm滤膜过滤溶液后于4℃可保存1个月。

Tris•HCl/SDS，pH8.8,4×：

在300mLH2O中溶解91gTris（1.5mol/L），用1mol/LHCl调至pH8.8，补加H2O至总体积500mL，用0.45µm滤膜过滤溶液，再加入2gSDS[0.4%（W/V）]，于4℃可保存1个月。

Tris•HCl/SDS，pH6.8,8×：

在40mLH2O中溶解6.05gTris（0.5mol/L），用1mol/LHCl调至pH6.8，补加H2O至总体积100mL，用0.45µm滤膜过滤溶液，再加入0.4gSDS[0.4%（W/V）]，于4℃可保存1个月。

Tris•HCl/SDS，pH8.45：

在300mLH2O中溶解182gTris（3.0mol/L），用1mol/LHCl调至pH8.45，补加H2O至总体积500mL。

用0.45µm滤膜过滤溶液，再加入1.5gSDS[0.3%（W/V），于4℃可保存1个月。

MOPS（3-吗啉代丙磺酸，分子量209.3）电泳缓冲液，10×：

0.4mol/LMOPS，pH7.0

0.5mol/LNaAc

0.01mol/LEDTA

HEPES（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸），分子量238.3）缓冲盐水（HeBS）：

137mmol/LNaCl

5mmol/LKCl

0.7mmol/LNa2HPO4

6mmol/L葡萄糖

21mmol/LHEPES

调至pH7.05；因为这是一个关键参数，因此应仔细检测。

HEPES缓冲盐水（ＨeBS），２×：

16.4gNaCl（0.283mol/L），0.2gNa2HPO4（1.5mmol/L）

11.9gHEPES酸（0.023mol/L）加H2O至1L

用5mol/LNaOH调至pH7.05（精确的pH值对有效的转染特别重要），过滤除菌。

许多研究者常配制大量的2×HeBS，对溶液的转染效率进行检测后将其等量分装成50mL一份冻存。

从两批2×HeBS溶液获得的转染效率可能有较大的差异。

每一批新鲜配制的溶液都要检查其转染效率。

通过将0.5mL2×HeBS与0.5mL250mmol/LCaCl2溶液混合并旋涡振荡可快速检测2×HeBS溶液的转染效率。

在显微镜下即可很快观测到微小的沉淀形成。

溶液的转染效率必须一直检查，但如果在检查时溶液中不形成沉淀，这可能发生了某种错误。

Hanks平衡盐溶液（HBss）：

5.4mmol/LKCl

0.3mmol/LNa2HPO4

0.4mmol/LKH2PO4

4.2mmol/LNaHCO3

1.3mmol/LCaCl2

0.5mmol/LMgCl2

0.6mmol/LMgSO4

137mmol/LNaCl

5.6mmol/LD-葡萄糖

0.02%（W/V）酚红（可选）

加H2O至1L并调pH至7.4

HBss可从Biofluids或Whittaker公司购买。

不含CaCl2和MgCl2的HBss可配制或购买。

其中可选用的成分通常对实验并无影响，但它们的出现可能对某一过程有损害。

针对单个的方案，决定是否使用这些成分并在“材料”栏中进行了推荐。

TE缓冲液，pH7.4，7.5，或8.0：

10mmol/LTris·HCl，pH7.4，7.5，或8.0

1mmol/LEDTA，pH8.0

TAE（Tris-乙酸）电泳缓冲液：

50×贮存液，pH约8.5：

242gTris碱

57.1mL冰醋酸

37.2gNa2EDTA·2H2O

加H2O至1L

1×工作液：

40mmol/LTris·Ac

2mmol/LEDTA

1mg/mLBSA（可选）

TBE（Tris-硼酸）电泳缓冲液：

10×贮存液：

108gTris

55g硼酸

40mL0.5mol/LEDTA，pH8.0

加H2O至1L

1×工作液：

89mmol/LTris

89mmol/L硼酸

2mmol/LEDTA

TPE（Tris-磷酸）电泳缓冲液：

10×贮存液：

108gTris碱

15.5mL85%（1.679g/mL）磷酸

40mL0.5mol/LEDTA，pH8.0

TM缓冲液，10×：

100mmol/LTris·HCl，pH8.0

100mmol/LMgCl2

在150mLH2O中溶解385.4gNH4Ac，补加水至500mL。

TES缓冲液：

10mmol/LTris·HCl，pH8.0

10mmol/LNaCl

1mmol/LEDTA

碱性电泳加样缓冲液（Loadingbuffer），10×：

18%（W/V）Ficoll400

6mmol/LNa2EDTA，pH8.0

30mmol/LNaOH

0.25%（W/V）溴甲酚蓝

0.25%（W/V）二甲苯青FF（可选；迁移速度只有溴酚蓝的约50%，而且可能干扰中等量分装子量蛋白带的显色，但它可对长时间的电泳提供有益的指示）。

于4℃保存

电泳加样缓冲液Ⅰ，6×：

0.25%（W/V）溴酚蓝，0.25%（W/V）二甲苯青FF，30%甘油水溶液，于4℃保存

电泳加样缓冲液Ⅱ,6×：

0.25%（W/V）溴酚蓝，0.25%（W/V）二甲苯青FF，40%蔗糖水溶液，于4℃保存

电泳加样缓冲液Ⅲ，6×

0.25%（w/v）溴酚蓝，0.25%（W/V）二甲苯青FF，15%聚蔗糖（Ficoll400）水溶液，于4℃保存

溴化乙锭，10mg/mL：

在20mLH2O中溶解0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，混匀后于4℃保存，溶液应避光。

小心：

溴化乙锭是一种诱变剂，必须小心操作

EDTA钠盐（乙二胺四乙酸二钠），0.5mol/L：

在700mLH2O中溶解186.1gNa2EDTA·2H2O，用10mol/LNaOH调至pH8.0（约50mL），补加H2O定容至1L，高压灭菌。

二硫苏糖醇（DTT），1mol/L：

在100mLH2O中溶解15.45gDTT，于－20℃保存

SSC，20×：

3mol/LNaCl（175.5g）

0.3mol/L柠檬酸三钠·2H2O（88.2g/L）

用1mol/LHCl或10mol/LNaOH溶液调校至pH7.0

加水定容至1L，分装后高压灭菌。

SSPE，20×：

174gNaCl，

27.6gNaH2PO4·2H2O，

7.4gNa2EDTA·2H2O

溶解在800mL水中，用10mol/LNaOH调pH到7.4，再加水到1L，高压灭菌。

乙酸氨（NH4Ac），10mol/L：

将770.8gNH4Ac溶解在800mL蒸馏水中，加H2O定容至1L，过滤灭菌。

乙酸钠（NaAc，pH5.2，pH8.0），3mol/L：

将408.1gNaAc·3H2O溶于水，用3mol/L冰乙酸调校至pH5.2，或稀释过的冰乙酸调pH值至7.0，补加水定容至1L。

乙酸钠缓冲液，0.1mol/L：

溶液A：

11.55mL冰醋酸/L（0.2mol/L）

溶液B：

27.2gNaAc·3H2O/L（0.2mol/L）

参照表2找到所需的pH值，按表中给出的溶液体积分别将溶液A和溶液B混合，然后用H2O稀释至200mL（详情请见乙酸钾缓冲液配方）。

乙酸钾溶液，pH4.8，5mol/L：

29.5mL冰乙酸

KOH颗粒调校至pH4.8（几粒）

H2O加至100mL

室温保存（不可高压灭菌）

乙酸钾溶液，pH5.5，3mol/L：

294gKAc

50mL90%甲酸（1.18mol/L）

加水至1L

乙酸钾盐缓冲液，0.1mol/L：

溶液A：

11.55mL冰醋酸（0.2mol/L）溶于1000mL水中

溶液B：

19.6gKAc（0.2mol/L）溶于1000mL水中

参照表附1－2找到所需的pH值，混合一定体积的溶液A和溶液B，然后用H2O稀释至200mL。

在一定体积内通过扩大乙酸钾的量可以把浓度提高5～10倍。

乙酸缓冲液具有浓度依赖性的pH变化，所以把一份的量稀释至最终浓度后再检测浓缩液的pH值。

如制备缓冲液的pH值在表2所列值之间，则先制备最接近的高pH值，再用溶液A调pH。

表附1－2制备0.1mol/L乙酸钠和乙酸钾缓冲液

pH值

溶液A（mL）

溶液B（mL）

3.6

46.3

3.7

3.8

44.0

6.0

4.0

41.0

9.0

4.2

36.8

13.2

4.4

30.5

19.5

4.6

25.5

24.5

4.8

20.0

30.0

5.0

14.8

35.2

5.2

10.5

39.5

5.4

8.8

41.2

5.6

4.8

45.2

a得到惠许选自CRC，1975。

磷酸缓冲盐溶液（PBS），10×和1×：

10×贮存液，1000mL：

1×工作液，pH约为7.3：

80gNaCl137mmol/LNaCl

2gKCl2.7mmol/LKCl

11.5gNa2HPO4·7H2O4.3mmol/LNa2HPO4·7H2O

2gKH2PO41.4mmol/LKH2PO4

磷酸钾缓冲液，1mol/L，pH8.0：

A：

1mol/LK2HPO4

B：

1mol/LKH2PO4

将A液加到B液中至pH8.0

磷酸钠缓冲液，0.1mol/L：

溶液A：

27.8gNaH2PO4·2H2O（0.2mol/L）溶于100mL水中。

溶液B：

53.65gNa2HPO4·7H2O或71.7g（0.2mol/L）Na2HPO4·12H2O溶于1000mL水中。

参照表3找到所需的pH值，按所给出的溶液A和溶液B体积混合，然后补加H2O至200mL（详情见磷酸钾缓冲液配方）。

磷酸钾缓冲液，0.1mol/L：

溶液A：

27.2gKH2PO4（0.2mol/L）溶于1000mL水中

溶液B：

45.6gK2HPO4（0.2mol/L）溶于1000mL水中

参照表附－3所列pH值，混合一定体积的溶液A和溶液B，然后用H2O稀释至200mL。

可扩大磷酸钾的量制备5～10倍的浓缩液。

磷酸盐缓冲液具有浓度依赖性的pH变化，稀释至最终浓度后再检测浓缩液的pH值。

表附－3制备0.1mol/L磷酸钠和磷酸钾缓冲液a

pH值

溶液A（mL）

溶液B（mL）

pH值

溶液A（mL）

溶液B（mL）

5.7

93.5

6.5

6.9

45.0

55.0

5.8

92.0

8.0

7.0

39.0

61.0

5.9

90.0

10.0

7.1

33.0

67.0

6.0

87.7

12.3

7.2

28.0

72.0

6.1

85.0

15.0

7.3

23.0

77.0

6.2

81.0

18.5

7.4

19.0

81.0

6.3

77.5

22.5

7.5

16.0

84.0

6.4

73.5

26.5

7.6

13.0

87.0

6.5

68.5

31.5

7.7

10.5

90.0

6.6

62.5

37.5

7.8

8.5

91.5

6.7

56.5

43.5

7.9

7.0

93.0

6.8

51.0

49.0

8.0

5.3

94.7

a.得到惠许选自CRC，1975。

溴化乙锭检测液：

将10mL10×TNE缓冲液加入89.5mLH2O中，用0.45m滤膜过滤，然后补加0.5mL1mg/mL溴化乙锭。

之所以要过滤后补加染料，是因为过滤时溴化乙锭可与绝大多数滤膜结合。

小心：

溴化乙锭具有毒性，在进行操作、贮存和处理时应戴手套并十分小心。

葡萄糖/Tris/EDTA（GTE）溶液：

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris·HCl，pH8.0

10mmol/LEDTA，pH8.0

NaOH/SDS溶液：

0.2mol/LNaOH

1%（W/V）SDS

用10mol/LNaOH和10%SDS新鲜配制

CaCl2溶液：

60mmol/LCaCl2

15%（V/V）甘油

10mmol/LPIPES，pH7.0

使用一次性过滤除菌，或高压灭菌。

β-巯基乙醇（BME）：

一般得到的是14.4mol/L溶液，应装在棕色瓶中保存4℃保存。

Ｘ-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）溶液：

Ｘ-gal用二甲基甲酰胺溶解配制成20mg/mL的储存液。

用PBS制备：

5～35mmol/LK3Fe（CN）6（铁氰化钾）

5～35mmol/LK3Fe（CN）6•3H2O（亚铁氰化钾）

1～2mmol/LMgCl2或MgSO4

临用前，加入溶于二甲基甲酰胺中的40×X-gal至终浓度1mg/mL

小心：

应避免接触和吸入氰化物，按实验室操作指南丢弃废物。

使用的铁和亚铁氰化物的量对获得最佳结果十分关键。

量越多引起吲哚的沉淀越快，这样可减少扩散。

然而，尽管至细胞系中不经常出现，但在某些组织中延长温育时间（过夜或更长时间）可能会产生绿色背景。

前三个成分（包括X-gal）在室温至少可保存几个月，40×X-gal可在玻璃容器或聚丙烯管中用锡箔纸包裹好于—20℃保存。

碘化钠（NaI）溶液，6mol/L：

将0.75gNa2SO3溶于40mL水中，加入45gNaI（Sigma）并搅拌直至完全溶解（约30min）。

用Whatman滤纸或硝酸纤维素膜过滤，在暗处可贮存3~4个月（用锡箔纸严密包裹）。

如果出现可见的沉淀应该丢弃。

消化缓冲液：

100mmol/LNaCl

10mmol/LTris·HCl，pH8.0

25mmol/LEDTA，pH8.0

0.5%（W/V）SDS

0.1mg/mL蛋白酶K

蛋白酶K不稳定，应在每次临用前加入。

高盐TE缓冲液：

10mmol/LTris·HCl，pH8.0

0.1mmol/LEDTA，pH8.0

1mol/LNaCl

于室温保存（可以在几年内保持稳定）

CTAB抽提液：

2%（W/V）CTAB（十六烷基三乙酸溴化铵）

100mmol/LTris·HCl，pH8.0

20mmol/LEDTA，pH8.0

1.4mol/LNaCl

于室温保存（可以在几年内保持稳定）

CTAB/NaCl溶液（10%CTAB/0.7mol/LNaCl）：

在80mL水中溶解4.1gNaCl，缓慢加入10gCTAB（十六烷基三乙酸溴化铵），同时加热并搅拌。

如果需要，可以加热至65℃溶解。

定容终体积至100mL。

CTAB沉淀液：

1%（W/V）CTAB

50mmol/LTris·HCl，pH8.0

10mmol/LEDTA，pH8.0

于