附录基因工程操作中常用的溶液和缓冲液.docx

1、附录基因工程操作中常用的溶液和缓冲液附录一 分子生物学实验中常用的溶液和缓冲液一、 酸、碱和盐溶液的配制盐酸（HCl，分子量36.5，重量百分比36%），1 mol/L按以下顺序混合：912.5 mL H2O；87.5 mL浓盐酸。盐酸（HCl，分子量36.5，重量百分比36%），0.25N/L按以下顺序混合：978.4 mL H2O；21.6 mL浓盐酸。硫酸（H2SO4，分子量98.07，重量百分比96%），1 mol/L按以下顺序混合：944.8 mL H2O；55.6 mL浓硫酸。硝酸（HNO3，分子量63.02，重量百分比71%），1 mol/L按以下顺序混合：937.5 mL H2

2、O；62.5 mL硝酸冰醋酸（CH3COOH，分子量60.05，重量百分比99.5%），1 mol/L按以下顺序混合：942.5 mL H2O；57.5 mL冰醋酸。乙酸（CH3COOH，分子量60.5，重量百分比36%），1 mol/L按以下顺序混合：840.5 mL H2O；159.5 mL 乙酸。甲酸（HCOOH，分子量46.02，重量百分比90%），1 mol/L按以下顺序混合：957.3 mL H2O；42.7 mL甲酸。高氯酸（HClO4，分子量100.5，重量百分比70%），1 mol/L 按以下顺序混合：914.5 mL H2O；85.5 mL 高氯酸。氢氧化钾（KOH，分子量

3、56.1），1 mol/L56.0 g KOH溶解于1 L H2O中。氢氧化钠（NaOH，分子量40.0），1 mol/L将40.0 g NaOH溶解于450 mL H2O中，补加H2O至1 L。氢氧化钠(NaOH，分子量40.0)，10 mol/L将400 g NaOH溶于450 mL水中，补加H2O至1 L。氨水（NH4OH，分子量35.0，重量百分比25%），1 mol/L按以下顺序混合：924.9 mL H2O；75.1 mL氨水。尿素（CH4N2O，分子量60.06），8 mol/L分批将480.5 g尿素溶解在600 mL蒸馏水中，加H2O定容只至1 L，过滤灭菌。氯化钠（NaCl

4、，分子量58.5），5 mol/L将292.5 g NaCl溶于450 mL H2O中，补加H2O至1 L。氯化钾（KCl，分子量74.5），1 mol/L将74.5 g KCl 溶于450 mL H2O中，补加H2O定容至1 L。氯化镁（MgCl2，分子量203.3），1 mol/L将203.3 g MgCl26H2O溶于450 mL H2O中，加H2O至1 L，高压灭菌。硫酸镁（MgSO4，分子量246.5），1 mol/L将246.5 g MgSO47H2O溶于450 mL H2O中，加H2O至1 L。 氯化钙（CaCl2，分子量147.0或219.1），1 mol/L将147.0 g

5、CaCl22H2O溶于450 mL H2O中，加H2O至1 L，或将219.1 g CaCl26H2O溶于450 mL H2O中，加H2O至1 L。二、各种常见缓冲液和平衡盐的配制10%SDS（十二烷基硫酸钠盐）： 称取100 g SDS溶解在800 mL水中，置68水浴中溶解，加数滴浓盐酸调pH到7.2，定容到1 000 mL，不需要消毒。禽血DNA提取裂解液：2 mol/L尿素100 mmol/L TrisHCl（pH 8.0）1% SDS100 mmol/L EDTA现配现用，无需灭菌。配制方法：600 mL蒸馏水中，顺序加入120.12 g尿素，待溶解后加入100 mL 1 mol/L

6、 Tris（pH 8.0），溶解后加入37.2 g Na2EDTA2H2O，溶解后缓缓加入20% SDS 50 mL，定容至1000 mL。细菌DNA提取裂解液：25 mmol/L TrisHCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），50 mmol/L葡萄糖，使用前加溶菌酶（2 mg/mL）。细菌DNA提取裂解液（碱-1% SDS）：1%（W/V）SDS溶解在0.2 mol/L NaOH中。酚(phenol)：（1）现在有商品酚可直接购买，但是要注意酚的pH值。（2）酚的纯化和配制（提取核酸用的酚溶液）：如果购的酚不纯，例如市售酚含有杂质，常呈粉色或淡黄色，需要重蒸二

7、次：用前从冰箱中取出，在68水浴锅中溶解结晶酚，160左右蒸馏后，冷却至0，加入8-羟基喹啉（100 g酚加0.1g8-羟基喹啉），酚变为黄色，8-羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8-羟基喹啉的酚用等体积0.5 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）磁力搅拌器搅拌20 min，约半小时后两相完全分开，用真空抽液器尽可能吸去上层水相，再加入等体积的0.1 mol/L Tris（pH 8.0）至酚中，搅拌20 min，再吸去上层水相，反复数次，至酚相pH值大于7.8，加入0.2%-巯基乙醇和0.1 mol/L Tris（pH 8.0）分装在棕色瓶中，此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4可

8、保存1个月，纯化和配制酚溶液都要戴手套，以免损伤皮肤。酚氯仿异戊醇：酚、氯仿和异戊醇按25241（V/V）混合而成，加终浓度为0.1%的8-羟基喹啉，上面覆盖一层1cm厚的0.1 mol/L Tris（pH 8.0），分成几份储存于-20，超过6个月则废弃。它用来除去核酸中的蛋白质，异戊醇能消泡沫，有利于水相和有机相分开，氯仿异戊醇混合液密闭瓶中保存。Tris-Cl Tris（三羟甲基氨基甲烷），1 mol/L在800 mL水中溶解121.1g Tris，常温下用浓盐酸调至所需的pH值，常用pH 7.4，或pH 8.0，混匀后加水定容至1 L，高压灭菌。要获得所需的某一特定pH的0.1 mol

9、/L TrisHCl缓冲液的配制，可通过将一定数量的0.1 mol/L HCl 和100 mL 0.1 mol/L Tris溶液混合，如下表 附1所示：表 附1 特定pH的0.1 mol/L TrisHCl缓冲液的配制所需的0.1 mol/L HCl的毫升数pH (25)1.1 mol/L HCl（mL）pH (25)0.1 mol/LHCl（mL）pH (25)0.1 mol/LHCl（mL）7.289.47.869.08.434.47.386.87.964.08.529.47.484.08.058.48.624.87.580.68.152.48.720.67.677.08.245.88.8

10、17.07.773.28.339.88.914.0注意：Tris缓冲液的pH值随温度变化较大，每1可引起大约0.028 pH单位的变化。Tris缓冲液的pH值应调校至待使用温度下的pH值。因为Tris的pKa值为8.08，因此Tris不应该在大约pH 7.2以下和pH 9.0以上用作缓冲液。TrisHCl，pH 6.8, 4：在40 mL H2O中溶解6.05 g Tris (0.5 mol/L)，用1 mol/L HCl调至pH 6.8，补加H2O至整体积100 mL，用0.45 m滤膜过滤溶液后于4可保存1个月。TrisHCl，pH 8.8, 8：在300 mL H2O中溶解182 g T

11、ris (3 mol/L)，用1 mol/L HCl调至pH 8.8，补加H2O至整体积500 mL，用0.45 m滤膜过滤溶液后于4可保存1个月。TrisHCl/SDS，pH 8.8, 4：在300 mL H2O中溶解91 g Tris (1.5 mol/L)，用1 mol/L HCl调至pH 8.8，补加H2O至总体积500 mL，用0.45 m滤膜过滤溶液，再加入2 g SDS 0.4%(W/V)，于4可保存1个月。TrisHCl/SDS，pH 6.8, 8：在40 mL H2O中溶解6.05 g Tris (0.5 mol/L)，用1 mol/L HCl调至pH 6.8，补加H2O至总

12、体积100 mL，用0.45 m滤膜过滤溶液，再加入0.4 g SDS 0.4%(W/V)，于4可保存1个月。TrisHCl/SDS，pH 8.45：在300 mL H2O中溶解182 g Tris（3.0 mol/L），用1 mol/L HCl调至pH 8.45，补加H2O至总体积500 mL。用0.45 m滤膜过滤溶液，再加入1.5 g SDS 0.3% (W/V)，于4可保存1个月。MOPS（3-吗啉代丙磺酸，分子量209.3）电泳缓冲液，10：0.4 mol/L MOPS，pH 7.00.5 mol/L NaAc0.01 mol/L EDTA HEPES（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙

13、磺酸），分子量238.3）缓冲盐水（HeBS）：137 mmol/L NaCl5 mmol/L KCl0.7 mmol/L Na2HPO46 mmol/L 葡萄糖21 mmol/L HEPES调至pH 7.05；因为这是一个关键参数，因此应仔细检测。HEPES缓冲盐水（eBS），：16.4 g NaCl (0.283 mol/L)，0.2 g Na2HPO4 (1.5 mmol/L)11.9 g HEPES 酸（0.023 mol/L）加H2O至1 L用5 mol/L NaOH调至pH 7.05 (精确的pH值对有效的转染特别重要)，过滤除菌。许多研究者常配制大量的2HeBS，对溶液的转染效率

14、进行检测后将其等量分装成50 mL一份冻存。从两批2HeBS溶液获得的转染效率可能有较大的差异。每一批新鲜配制的溶液都要检查其转染效率。通过将0.5 mL 2HeBS与0.5 mL 250 mmol/L CaCl2溶液混合并旋涡振荡可快速检测2HeBS溶液的转染效率。在显微镜下即可很快观测到微小的沉淀形成。溶液的转染效率必须一直检查，但如果在检查时溶液中不形成沉淀，这可能发生了某种错误。Hanks 平衡盐溶液 (HBss)：5.4 mmol/L KCl0.3 mmol/L Na2HPO40.4 mmol/L KH2PO 44.2 mmol/L NaHCO31.3 mmol/L CaCl20.5

15、 mmol/L MgCl20.6 mmol/L MgSO4137 mmol/L NaCl5.6 mmol/L D-葡萄糖0.02%(W/V)酚红(可选)加H2O至1 L并调pH至7.4HBss可从Biofluids 或Whittaker公司购买。不含CaCl2和MgCl2的HBss可配制或购买。其中可选用的成分通常对实验并无影响，但它们的出现可能对某一过程有损害。针对单个的方案，决定是否使用这些成分并在“材料”栏中进行了推荐。TE缓冲液，pH 7.4，7.5，或8.0：10 mmol/L TrisHCl，pH 7.4，7.5，或8.01 mmol/L EDTA，pH 8.0TAE（Tris-乙

16、酸）电泳缓冲液：50贮存液，pH约8.5：242 g Tris碱57.1 mL 冰醋酸37.2 g Na2EDTA2H2O加H2O至1 L1工作液：40 mmol/L TrisAc2 mmol/L EDTA1 mg/mL BSA（可选）TBE（Tris-硼酸）电泳缓冲液：10贮存液：108 g Tris55 g 硼酸40 mL 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0加H2O至1 L1工作液：89 mmol/L Tris89 mmol/L硼酸2 mmol/L EDTATPE（Tris-磷酸）电泳缓冲液：10贮存液：108 g Tris碱15.5 mL 85%（1.679 g/mL）磷酸40

17、mL 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0TM缓冲液，10：100 mmol/L TrisHCl，pH 8.0100 mmol/L MgCl2在150 mL H2O中溶解385.4 g NH4Ac，补加水至500 mL。TES缓冲液：10 mmol/L TrisHCl，pH 8.010 mmol/L NaCl1 mmol/L EDTA碱性电泳加样缓冲液（Loading buffer），10：18%（W/V）Ficoll4006 mmol/L Na2EDTA，pH 8.030 mmol/L NaOH0.25%( W/V)溴甲酚蓝0.25%( W/V)二甲苯青FF（可选；迁移速度只有溴酚蓝的

18、约50%，而且可能干扰中等量分装子量蛋白带的显色，但它可对长时间的电泳提供有益的指示）。于4保存电泳加样缓冲液，6：0.25%( W/V)溴酚蓝，0.25%( W/V )二甲苯青FF，30%甘油水溶液，于4保存电泳加样缓冲液, 6：0.25%( W/V)溴酚蓝，0.25%( W/V )二甲苯青FF，40%蔗糖水溶液，于4保存电泳加样缓冲液，60.25%(w/v)溴酚蓝，0.25%( W/V)二甲苯青FF，15%聚蔗糖（Ficoll400）水溶液，于4保存溴化乙锭，10 mg/mL：在20 mL H2O 中溶解0.2 g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，混匀后于4保存，溶液应避光。小心：

19、溴化乙锭是一种诱变剂，必须小心操作EDTA钠盐（乙二胺四乙酸二钠），0.5 mol/L：在700 mL H2O 中溶解186.1 g Na2EDTA2H2O，用10 mol/ L NaOH调至pH 8.0（约50 mL），补加H2O定容至1 L，高压灭菌。二硫苏糖醇（DTT），1 mol/ L：在100 mL H2O 中溶解15.45 g DTT，于20保存SSC，20：3 mol/L NaCl（175.5 g）0.3 mol/L 柠檬酸三钠2H2O（88.2 g/L）用1mol/L HCl或10 mol/L NaOH溶液调校至pH 7.0加水定容至1 L，分装后高压灭菌。SSPE，20：17

20、4 g NaCl，27.6 g NaH2PO42H2O，7.4 g Na2EDTA2H2O溶解在800 mL水中，用10 mol/L NaOH调pH到7.4，再加水到1 L，高压灭菌。乙酸氨（NH4Ac），10 mol/L：将770.8 g NH4Ac溶解在800 mL蒸馏水中，加H2O定容至1 L，过滤灭菌。乙酸钠（NaAc，pH5.2，pH8.0），3 mol/L：将408.1 g Na Ac3H2O溶于水， 用3 mol/L冰乙酸调校至pH 5.2，或稀释过的冰乙酸调pH值至7.0，补加水定容至1L。乙酸钠缓冲液，0.1 mol/L：溶液A：11.55 mL 冰醋酸 /L（0.2 mol

21、/L）溶液B：27.2 g Na Ac3H2O/L（0.2 mol/L）参照表2 找到所需的pH值，按表中给出的溶液体积分别将溶液A和溶液B混合，然后用H2O稀释至200 mL（详情请见乙酸钾缓冲液配方）。乙酸钾溶液，pH 4.8，5 mol/L：29.5 mL冰乙酸KOH颗粒调校至pH 4.8（几粒）H2O加至100 mL室温保存（不可高压灭菌）乙酸钾溶液，pH5.5，3 mol/L：294 g KAc50 mL90%甲酸（1.18 mol/L）加水至1 L乙酸钾盐缓冲液，0.1 mol/L：溶液A：11.55 mL 冰醋酸（0.2 mol/L）溶于1000 mL水中溶液B：19.6 g K

22、Ac（0.2 mol/L）溶于1000 mL水中参照表附12 找到所需的pH值，混合一定体积的溶液A和溶液B，然后用H2O稀释至200 mL。在一定体积内通过扩大乙酸钾的量可以把浓度提高510倍。乙酸缓冲液具有浓度依赖性的pH变化，所以把一份的量稀释至最终浓度后再检测浓缩液的pH值。如制备缓冲液的pH值在表2所列值之间，则先制备最接近的高pH值，再用溶液A调pH。表 附12 制备0.1 mol/L乙酸钠和乙酸钾缓冲液pH值溶液A（mL）溶液B（mL）3.646.33.73.844.06.04.041.09.04.236.813.24.430.519.54.625.524.54.820.030.

23、05.014.835.25.210.539.55.48.841.25.64.845.2a得到惠许选自CRC，1975。磷酸缓冲盐溶液（PBS），10和1：10贮存液，1000 mL： 1工作液，pH约为7.3：80 g NaCl 137 mmol/L NaCl 2 g KCl 2.7 mmol/L KCl11.5 g Na2HPO47H2O 4.3 mmol/L Na2HPO47H2O2 g KH2PO4 1.4 mmol/L KH2PO4磷酸钾缓冲液，1 mol/L，pH 8.0：A：1 mol/L K2HPO4 B：1 mol/L KH2PO4将A液加到B液中至pH 8.0磷酸钠缓冲液，0

24、.1 mol/L：溶液A：27.8 g NaH2PO42H2O（0.2 mol/L）溶于100 mL水中。溶液B：53.65 g Na2HPO47H2O或71.7g（0.2 mol/L）Na2HPO412H2O溶于1000 mL水中。参照表3 找到所需的pH值，按所给出的溶液A和溶液B体积混合，然后补加H2O至200 mL（详情见磷酸钾缓冲液配方）。磷酸钾缓冲液，0.1 mol/L：溶液A：27.2 g KH2PO4（0.2 mol/L）溶于1000 mL水中溶液B：45.6 g K2HPO4（0.2 mol/L）溶于1000 mL水中参照表附3所列pH值，混合一定体积的溶液A和溶液B，然后用

25、H2O稀释至200 mL。可扩大磷酸钾的量制备510倍的浓缩液。磷酸盐缓冲液具有浓度依赖性的pH变化，稀释至最终浓度后再检测浓缩液的pH值。表 附3 制备0.1 mol/L磷酸钠和磷酸钾缓冲液apH值溶液A（mL）溶液B（mL）pH值溶液A（mL）溶液B（mL）5.793.56.56.945.055.05.892.08.07.039.061.05.990.010.07.133.067.06.087.712.37.228.072.06.185.015.07.323.077.06.281.018.57.419.081.06.377.522.57.516.084.06.473.526.57.613.

26、087.06.568.531.57.710.590.06.662.537.57.88.591.56.756.543.57.97.093.06.851.049.08.05.394.7 a. 得到惠许选自CRC，1975。溴化乙锭检测液：将10 mL 10TNE缓冲液加入89.5 mL H2O中，用0.45 m滤膜过滤，然后补加0.5 mL 1 mg/mL溴化乙锭。之所以要过滤后补加染料，是因为过滤时溴化乙锭可与绝大多数滤膜结合。小心：溴化乙锭具有毒性，在进行操作、贮存和处理时应戴手套并十分小心。葡萄糖/Tris/EDTA（GTE）溶液：50 mmol/L葡萄糖25 mmol/L TrisHCl，

27、pH 8.010 mmol/L EDTA，pH 8.0NaOH/SDS 溶液：0.2 mol/L NaOH1%（W/V）SDS用10 mol/L NaOH和10%SDS新鲜配制CaCl2溶液：60 mmol/L CaCl215%（V/V）甘油10 mmol/L PIPES，pH 7.0使用一次性过滤除菌，或高压灭菌。-巯基乙醇（BME）：一般得到的是14.4 mol/L溶液，应装在棕色瓶中保存4保存。-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）溶液：-gal用二甲基甲酰胺溶解配制成20 mg/mL的储存液。用PBS制备：535 mmol/L K3Fe(CN)6 (铁氰化钾)535 mmo

28、l/L K3Fe(CN)63H2O (亚铁氰化钾)12 mmol/L MgCl2或MgSO4临用前，加入溶于二甲基甲酰胺中的40X-gal至终浓度1 mg/mL小心：应避免接触和吸入氰化物，按实验室操作指南丢弃废物。使用的铁和亚铁氰化物的量对获得最佳结果十分关键。量越多引起吲哚的沉淀越快，这样可减少扩散。然而，尽管至细胞系中不经常出现，但在某些组织中延长温育时间（过夜或更长时间）可能会产生绿色背景。前三个成分（包括X-gal）在室温至少可保存几个月，40X-gal可在玻璃容器或聚丙烯管中用锡箔纸包裹好于20保存。碘化钠（NaI）溶液，6 mol/L：将0.75 g Na2SO3溶于40 mL水

29、中，加入45 g NaI（Sigma）并搅拌直至完全溶解（约30 min）。用Whatman滤纸或硝酸纤维素膜过滤，在暗处可贮存34个月（用锡箔纸严密包裹）。如果出现可见的沉淀应该丢弃。消化缓冲液：100 mmol/L NaCl10 mmol/L TrisHCl，pH 8.025 mmol/L EDTA ，pH 8.00.5%（W/V）SDS0.1 mg/mL 蛋白酶K蛋白酶K不稳定，应在每次临用前加入。高盐TE缓冲液：10 mmol/L TrisHCl，pH 8.00.1 mmol/L EDTA，pH 8.01 mol/L NaCl于室温保存（可以在几年内保持稳定）CTAB抽提液：2%（W/V）CTAB（十六烷基三乙酸溴化铵）100 mmol/L TrisHCl，pH 8.020 mmol/L EDTA，pH 8.01.4 mol/L NaCl于室温保存（可以在几年内保持稳定）CTAB/ NaCl溶液（10%CTAB/0.7 mol/L NaCl）：在80 mL水中溶解4.1 g NaCl，缓慢加入10 g CTAB（十六烷基三乙酸溴化铵），同时加热并搅拌。如果需要，可以加热至65溶解。定容终体积至100 mL。CTAB沉淀液：1%（W/V）CTAB50 mmol/L TrisHCl，pH 8.010 mmol/L EDTA，pH 8.0于