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原核表达技术

窗体底端

原核表达技术流程pMD19-T载体目的基因的获取TG1感受态制备PCR扩增连接重组载体1转化转化细胞1抽取质粒进行电泳,PCR检测阳性（阳性）转化细胞1酶切,获取目的基因TG1感受态细胞pET-28a载体重组重组载体2重组载体2转化BL21感受态转化细胞2抽取质粒进行电泳,PCR检测阳性（阳性）转化细胞2诱导表达蛋白质提取,电泳检测呈阳性目的蛋白

原核表达技术及其在相关领域的应用

窗体底端

原核表达技术及其在相关领域的应用

1基因工程及其应用原核表达载体的构建蛋白质的诱导与表达

基因工程：

是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主（细菌或其它细胞），筛选出能表达重组DNA的活细出能表达重组DNA筛选出能表达重组DNA的活细加以纯化、传代、扩增，胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆，成为克隆，产生出人类所需要的基因产物或改造、的基因产物或改造、创造新的生物类型。

生物类型。

Yourcompanyslogan基因工程的应用1.抗虫转基因植物1.抗虫转基因植物Yourcompanyslogan2.抗病转基因植物2.抗病转基因植物Yourcompanyslogan3.ThecamelecowYourcompanyslogan其他基因工程产品抗虫害的玉米转鱼抗寒基因的番茄转基因鲑鱼Yourcompanyslogan乳汁中含有人生长激素的转基因牛阿根廷）（阿根廷）转黄瓜抗青枯病基因的甜椒Yourcompanyslogan基因工程的应用领域1.2.3.4.5.6.蛋白质功能研究生物制药和疫苗生产疾病的基因治疗食品、化工用酶制剂抗虫、抗逆植物改良细胞代谢产物的富集Yourcompanyslogan基因工程一般流程人的细胞提取目的基因与运载体DNA拼接拼接与运载体导入细菌（含目的基因细菌含目的基因）含目的基因生产重组蛋白Yourcompanyslogan基因工程的操作工具核酸分子剪刀----限制性核酸内切酶一.核酸分子剪刀限制性核酸内切酶识别回文序列，产生粘性或平性末端，识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同DNA片段可连接起来形成重组片段可连接起来形成重组DNA分子，故分子，末端的不同片段可连接起来形成重组分子DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。

识限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。

限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键别双链内部特异位点并裂解磷酸二酯键分类：

分类：

Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名：

发现次序）命名：

EcoRⅠ（E：

属名；co：

种名；R：

株；Ⅰ：

发现次序Ⅰ：

属名；：

种名；：

Yourcompanyslogan第一类（第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，切割DNA链其切割的核苷酸顺序没有专一性，DNA是随机的。

这类限制性内切酶在DNADNA重组技术或是随机的。

这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNADNA结构或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。

克隆基因。

这类酶如EcoB、EcoK等。

第三类（III型第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。

位置上切割双链。

但这几个核苷酸对也不是特异性的。

因此，性的。

因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。

DNA片段定长度DNA片段，具有各种单链末端。

因此也不能应用于基因克隆。

能应用于基因克隆。

Yourcompanyslogan第二类（II型第二类（II型）限制性内切酶能识别专一（II的核苷酸顺序，的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。

切割双链。

由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。

因此，切割的核苷酸都是专一的。

因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶DNA之一。

之一。

这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的个或6个核苷酸，少数也有识别5是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及710个和11个核苷酸个和11酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。

这种酶的切割可以有两种方式：

Yourcompanyslogan粘性末端；是交错切割，粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。

成氢键，所以称为粘性末端。

RI的识别顺序为的识别顺序为：

如EcoRI的识别顺序为：

5’……G|AATTC……3’33’……CTTAA|G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成5’……GG3’……CTTAACTTAAAATTC……3’3AATTCG……5’5各有一个单链末端，二条单链是互补的，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNADNA连接酶其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶Yourcompanyslogan的作用而“粘合”的作用而“粘合”。

平头末端：

II型酶切割方式的另一种是在同一位置上II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。

切割双链，产生平头末端。

例如EcoRV的识别位置是：

位置是：

5’……GAT|ATC……3’3’……CTA|TAG……5’切割后形成5’……GAT3’……CTAATC……3’TAG……5’这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。

这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。

DNA连接酶连接起来Yourcompanyslogan同裂酶和同尾酶：

同裂酶和同尾酶：

同裂酶：

有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）同裂酶同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。

一种则不能。

例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……G|CGGG|CGG……3’33’……GGC|GGGC|G……5’5如果其中有5-甲基胞嘧啶，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。

能够切割。

Yourcompanyslogan同尾酶：

同尾酶：

有时两种酶切割序列不完全相同，有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将DNA这类末端连接起来，这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。

Yourcompanyslogan如Xba1和Nhe1:

GATC）来进行再切割。

Yourcompanyslogan二、DNA连接酶DNA连接酶催化双链DNA一端的3OH与催化双链DNA一端的3’OH与DNA一端的另一双链DNA5DNA5’的磷酸根形成另一双链DNA5的磷酸根形成磷酸二酯键，3’，5’-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平末端的DNADNA末相同粘性末端或平末端的DNA末端连接起来。

端连接起来。

Yourcompanyslogan三、DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶（DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）DNA聚合酶片段YourcompanysloganDNA聚合酶的DNA聚合酶的3种功能聚合酶的3聚合酶功能3’5’功能5’外切功能3’外切YourcompanysloganDNA聚合酶活性5’→3’DNA聚合酶活性→DNA聚合酶5’CCG3’GGCTATCGA5’dATPdTTPdGTPdCTP5’CCGATAGCT3’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGA5’Yourcompanyslogan3’→5’外切酶活性5’CCGATAGCT3’CCGATAGCT3’3’GGC5’聚合酶5’CCG3’3’GGC5’ATAGCTYourcompanysloganKlenow片段从大肠杆菌DNA聚合酶I中去除5’→3’外切酶活性，即得Klenow片段。

其只具有5’→3’聚合酶活性YourcompanysloganTaqDNA聚合酶特性：

①耐热的DNA聚合酶来自于嗜热的栖热水生菌Thermusaquaticus中纯化而来的。

②5’→3’聚合酶活性③5’→3’外切酶活性④最佳作用温度为75-80°CYourcompanyslogan载体基因工程中常用的载体（vector）主要包括质粒基因工程中常用的载体（vector）主要包括质粒（vector）主要包括（plasmid）、噬菌体（phage）病毒（virus）三大类。

（phage）和（virus）三大类（plasmid）、噬菌体（phage）和病毒（virus）三大类。

这些载体均需经人工构建，除去致病基因，这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。

单一的限制酶切点等。

Yourcompanyslogan质粒载体是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，独立复制的能力双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌抗药基因。

最早使用的质粒DNA是人工构建的的抗药基因。

最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，EcoRⅠBamHⅠ和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。

HindⅢ等单一的限制酶切点。

Yourcompanyslogan目Yourcompanyslogan录质粒载体的特征1.自主稳定复制松弛型质粒2.具有多种限制性内切酶酶切位点2.具有多种限制性内切酶酶切位点3.遗传标记3.遗传标记4.插入容量大4.插入容量大5.分子量小分子量小，5.分子量小，拷贝多6.安全6.安全Yourcompanyslogan目前常用商用载体pJLA50X系列pcDNAII;etc系列pET系列（T7promoter,Novagen公司公司）系列公司pQE系列（T5promoter,Qiagen公司公司）系列公司pMAL系列（周质表达BioLabs公司周质表达,公司）系列周质表达公司pGEX系列（GST融合表达,Pharmacia公司）pGEX系列（GST融合表达,Pharmacia公司）融合表达公司pBAD系列（Arabinose诱导型诱导型）系列诱导型YourcompanysloganYourcompanyslogan二、原核表达载体的构建1.目的基因的获取2.克隆载体的选择与构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体菌重组DNADNA导入受体菌5.重组体的筛选6.克隆基因的表达YourcompanysloganYourcompanyslogan目的基因的获取目的基因是人们所需要转移或改造的基因。

目的基因是人们所需要转移或改造的基因。

如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，人的胰岛素基因、干扰素基因等。

获取目的基因人的胰岛素基因、干扰素基因等。

的方法有1.从染色体DNA中分离2.人工合成1.从染色体DNA中分离2.人工合成从染色体DNA3.从mRNA合成3.从mRNA合成cDNA合成cDNA4.基因文库4.基因文库Yourcompanyslogan双酶切Yourcompanyslogan连接反应Yourcompanyslogan重组体的转化1.重组体导入大肠杆菌

（1）氯化钙法

（2）电击法（3）体外包装法2.重组体导入哺乳动物细胞

（1）磷酸钙共沉淀法

（2）脂质体介导法（3）病毒感染法（4）显微注射法YourcompanysloganDNA重组体的筛选与鉴定DNA重组体的筛选与鉴定1.目的基因检测1.目的基因检测2.DNA限制酶切图谱分析2.DNA限制酶切图谱分析3.根据重组载体的表型进行筛选3.根据重组载体的表型进行筛选4.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定4.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定Yourcompanyslogan常见注意事项1.载体的选择1.载体的选择2.酶切位点的选择与克隆引物的设计2.酶切位点的选择与克隆引物的设计3.酶切反应的设计3.酶切反应的设计4.酶切实验4.酶切实验5.连接比例的设置5.连接比例的设置6.连接温度与时间6.连接温度与时间7.感受态细胞的制备7.感受态细胞的制备8.转化8.转化9.重组子的鉴定9.重组子的鉴定Yourcompanyslogan载体的选择标准具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定具有两个以上的遗传标记物，有多个限制性内酶切位点，至少有两种酶能在同一体系有多个限制性内酶切位点，中反应。

中反应。

拷贝数高，表达量高，表达稳定。

具有强启动子和相应的表达标签和蛋白酶位点，具有强启动子和相应的表达标签和蛋白酶位点，便于表达产物的鉴定纯化。

达产物的鉴定纯化。

Yourcompanyslogan酶切位点的选择必须是选定载体的MCS必须是选定载体的MCS上的两种酶切位点MCS上的两种酶切位点尽量选用能产生粘性末端的限制性内切酶位点,尽量选用能产生粘性末端的限制性内切酶位点,并且上游酶切位点尽量靠近起始密码子。

且上游酶切位点尽量靠近起始密码子。

目的基因中不能含有选用的酶切位点两种酶尽可能在同一体系中反应，两种酶尽可能在同一体系中反应，并且具有相近的切割效率为了保证切割效率，为了保证切割效率，在设计的克隆引物的酶切位点前面必须加上合适的保护碱基。

点前面必须加上合适的保护碱基。

Yourcompanyslogan酶切反应大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

50条件下结冰当最终反应液中甘油浓度大于1212％当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑制酶活性。

降低，从而抑制酶活性。

因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的10%10%。

积的10%。

反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA底物的浓度不宜太大，基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，DNA会形成粘性DNA溶液基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活建议酶切反应的基因组DNA浓度为0DNA浓度为ug/ul。

同时RNARNA应性。

建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。

同时RNA应该尽量消化去除。

该尽量消化去除。

当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时必须选择好通用缓冲液，当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，DNA则两种酶才可同时切割。

则两种酶才可同时切割。

反应混合液中加入浓度为0.1mg/mlBSA，可维持酶的稳定性。

0.1mg/ml的反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。

酶切底物DNA应具备一定的纯度，如果溶液中含有迹量酚、氯仿、DNA应具备一定的纯度酶切底物DNA应具备一定的纯度，如果溶液中含有迹量酚、氯仿、乙大于10mMEDTA，SDS以及过量的盐离子浓度10mM的以及过量的盐离子浓度，醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，都会不同程度影响限制酶的活性。

度影响限制酶的活性。

Yourcompanyslogan连接反应连接比例的设置连接比例目的基因与载体量3：

1～8：

1，具体比例按照跑胶条带的亮度与宽度设计。

经验公式：

n（L1×K1×M2/L2×K2×M1）=1（1

如果超出范围按极值计算。

连接在16℃，12～16h.Yourcompanyslogan实例分析此时目的条带与载体亮度比宽度比为2：

，为1.5：

1，宽度比为：

1，：

目的条带600碱基，目的条带碱基，碱基载体按6000算，算出比例约为：

3，根据总载体按算算出比例约为10：

，体积为20ul,则加则加13ul基因，4ul载体，2ul连基因，载体，体积为则加基因载体连接buffer,1ul酶。

酶Yourcompanyslogan转化热击温度，热击温度，时间42℃,90s这里温度与时间一定要控制精确转化体系连接产物不能超过体系总体积的连接产物不能超过体系总体积的1/5对照设置初次做克隆，建议设置双对照，阴性对照：

初次做克隆，建议设置双对照，阴性对照：

以切开的质粒作为连接产物进行转化。

阳性对照：

的质粒作为连接产物进行转化。

阳性对照：

以载体质粒作为对照Yourcompanyslogan阳性克隆的鉴定菌落PCR鉴定菌落PCR鉴定对于大肠杆菌而言，一般1016h基本能长出克隆超过16h10基本能长出克隆，16h长出的小菌落对于大肠杆菌而言，一般10-16h基本能长出克隆，超过16h长出的小菌落或者卫星菌落一般不是重组子。

或者卫星菌落一般不是重组子。

连接产物生长的菌落一般不是很多，如果平板中菌落数非常多，可能是连接产物生长的菌落一般不是很多，如果平板中菌落数非常多，载体酶切不完全，自连严重。

也有可能是污染。

载体酶切不完全，自连严重。

也有可能是污染。

挑取克隆的时候以在规定时间范围内长出的单一菌落为主，挑取克隆的时候以在规定时间范围内长出的单一菌落为主，最好不要在菌落丛生很密的区域挑取克隆。

菌落丛生很密的区域挑取克隆。

挑取的克隆至小管培养45h,即可以用菌液做模板进行菌落PCR鉴定即可以用菌液做模板进行菌落PCR鉴定。

挑取的克隆至小管培养4-5h,即可以用菌液做模板进行菌落PCR鉴定。

双酶切鉴定菌落PCR鉴定为阳性的克隆要进一步小提质粒做双酶切鉴定。

PCR鉴定为阳性的克隆要进一步小提质粒做双酶切鉴定菌落PCR鉴定为阳性的克隆要进一步小提质粒做双酶切鉴定。

对于插入片段小的酶切鉴定，酶切时间不要太长，3h足够足够。

段小的酶切鉴定，酶切时间不要太长，2-3h足够。

防止切下的小片段弥散。

弥散。

Yourcompanyslogan示例图片Yourcompanyslogan表达鉴定经过菌落PCR鉴定和双酶切鉴定的重组子，PCR鉴定和双酶切鉴定的重组子经过菌落PCR鉴定和双酶切鉴定的重组子，一定要进行最后的表达鉴定。

行最后的表达鉴定。

只有看到与预期大小相近的蛋白表达，原核载体的构建才算成功。

蛋白表达，原核载体的构建才算成功。

将菌落PCR双酶切鉴定为阳性的克隆子，PCR，将菌落PCR，双酶切鉴定为阳性的克隆子，提质粒转化至表达工程菌中，BL21，然后诱导表达，化至表达工程菌中，如BL21，然后诱导表达，PET系列载体使用的是T7启动子，使用IPTG诱导。

T7启动子IPTG诱导系列载体使用的是T7启动子，使用IPTG诱导。

SDS-PAGE鉴定鉴定。

SDS-PAGE鉴定。

以未诱导作对照，以分子量marker作为大小鉴定。

marker作为大小鉴定以未诱导作对照，以分子量marker作为大小鉴定。

确定目的蛋白的表达。

Yourcompanyslogan蛋白质表达策略1.可溶性表达A:

优化表达条件实现可溶性表达降低诱导温度，降低诱导温度，振摇速度降低诱导物浓度培养基中添加促溶物质B:

融合表达采用Nus\MBD、GST、thioredoxin融合表达采用Nus\MBD、GST、thioredoxin融合表达C:

选择适宜宿主菌采用Origami，采用Origami，Rosetta等宿主菌D:

周质腔表达CBD融合（pET36/37）、Dsb融合CBD融合（pET36/37）、Dsb融合（pET39/40）采用带pelB/ompT引导肽的载体采用带pelB/ompT引导肽的载体（pET12/20/22）引导肽的载体（pET12/20/22）采用带MBD融合（pMAL载体载体,SUMO融合采用带MBD融合（pMAL载体,Biolabs）、SUMO融合Yourcompanyslogan2.包涵体表达并不是所有蛋白都能在大肠杆菌中实现可溶性表达，并不是所有蛋白都能在大肠杆菌中实现可溶性表达，绝大多数真核蛋白在大肠杆菌中是以包涵体形式存在的。

在大肠杆菌中是以包涵体形式存在的。

包涵体表达有以下优点表达量高表达产物对宿主细胞没有毒性表达条件不苛刻YourcompanysloganYourcompanyslogan

主要内容1基因工程及其应用原核表达载体的构建蛋白质的诱导与表达常见问题以及解决

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