原核表达技术.docx

1、原核表达技术窗体底端原核表达技术流程 pMD19-T载体 目的基因的获取 TG1感受态制备 PCR扩增 连接 重组载体1 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞1 酶切,获取目的基因 TG1感受态细 胞 pET-28a载体 重组 重组载体2 重组载体2 转化 BL21感受态 转化细胞2 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞2 诱导表达 蛋白质提取,电泳检测 呈阳性 目的蛋白 原核表达技术及其在相关领域的应用 窗体底端原核表达技术及其在相关领域的应用1 基因工程及其应用 原核表达载体的构建 蛋白质的诱导与表达基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA

2、在体外与载体DNA 结合，成为重组DNA， 用以转化宿主（细菌或其它细胞）， 筛选出能表达重组DNA的活细 出能表达重组DNA 筛选出能表达重组DNA的活细 加以纯化、传代、扩增， 胞，加以纯化、传代、扩增， 成为克隆， 成为克隆，产生出人类所需要 的基因产物或改造、 的基因产物或改造、创造新的 生物类型。 生物类型。 Your company slogan 基因工程的应用 1.抗虫转基因植物 1.抗虫转基因植物 Your company slogan 2.抗病转基因植物 2.抗病转基因植物 Your company slogan 3.The camelecow Your company sl

3、ogan 其他 基因工程产品抗虫害的玉米 转鱼抗寒基因 的番茄 转基因鲑 鱼 Your company slogan 乳汁中含有 人生长激素 的转基因牛 阿根廷) (阿根廷) 转黄瓜抗青枯病 基因的甜椒 Your company slogan 基因工程的应用领域 1. 2. 3. 4. 5. 6. 蛋白质功能研究 生物制药和疫苗生产 疾病的基因治疗 食品、化工用酶制剂 抗虫、抗逆植物改良 细胞代谢产物的富集 Your company slogan 基因工程一般流程 人的细胞 提取 目的基因 与运载体DNA拼接 拼接 与运载体 导入 细菌(含目的基因 细菌 含目的基因) 含目的基因 生产重组蛋白

4、 Your company slogan 基因工程的操作工具 核酸分子剪刀-限制性核酸内切酶 一. 核酸分子剪刀 限制性核酸内切酶 识别回文序列，产生粘性或平性末端， 识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性 末端的不同DNA片段可连接起来形成重组 片段可连接起来形成重组DNA分子，故 分子， 末端的不同 片段可连接起来形成重组 分子 DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。识 限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。 限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶 别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 别双链 内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类： 分类：型、型、型

5、命名： 发现次序) 命名：EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序 ：属名； ：种名； ： Your company slogan 第一类（ 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的 核苷酸顺序， 核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意 切割DNA链，其切割的核苷酸顺序没有专一性， 切割DNA链 其切割的核苷酸顺序没有专一性， DNA 是随机的。这类限制性内切酶在DNA DNA重组技术或 是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或 基因工程中用处不大，无法用于分析DNA DNA结构或 基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或 克隆基因。 克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。

6、 第三类（III型 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的 识别顺序， 识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定 位置上切割双链。 位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异 性的。因此， 性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一 定长度DNA片段，具有各种单链末端。 DNA片段 定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不 能应用于基因克隆。 能应用于基因克隆。 Your company slogan 第二类(II型 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一 (II 的核苷酸顺序， 的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上 切割双链。 切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和 切割的核苷酸都

7、是专一的。因此， 切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制 性内切酶是DNA 重组技术中最常用的工具酶 性内切酶是 DNA重组技术中最常用的工具酶 DNA 之一。 之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的 个或6 个核苷酸， 少数也有识别5 是 4 个或 6 个核苷酸 ， 少数也有识别 5 个核苷 酸以及7 10个和11个核苷酸 个和11 酸以及 7 个 、 8 个 、 9 个 、 10 个和 11 个核苷酸 的。这种酶的切割可以有两种方式： 这种酶的切割可以有两种方式： Your company slogan 粘性末端；是交错切割， 粘性末端；是交错切割，结果形成两条单 链末端，这种末端的核

8、苷酸顺序是互补的， 链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形 成氢键，所以称为粘性末端。 成氢键，所以称为粘性末端。 RI的识别顺序为 的识别顺序为： 如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 3 CTTAA|G 5 在双链上交错切割的位置切割后生成 5G G 3CTTAA CTTAA AATTC3 3 AATTC G5 5 各有一个单链末端， 二条单链是互补的， 各有一个单链末端 ， 二条单链是互补的 ， 其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA DNA连接酶 其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA 连接酶 Your company slogan 的作用而“粘合” 的作用而“

9、粘合”。 平头末端： 平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置上 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上 切割双链，产生平头末端。 切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别 位置是： 位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT 3 CTA ATC 3 TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 DNA连接酶连接起来 Your company slogan 同裂酶和同尾酶： 同裂酶和同尾酶： 同裂酶： 同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同， 核苷酸顺序和切割位置都相

10、同，这些有相同切 点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。 点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶） 同裂酶 同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化 的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割， 的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另 一种则不能。 一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都 是 5G|CG G G|CG G3 3 3G GC|G G GC|G5 5 如果其中有5 -甲基胞嘧啶， 如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa 能够切割。 能够切割。 Your company slogan 同尾酶： 同尾酶：有时两种酶切割序列不完全相同， 有时两种酶切割序列不完全相同，但却能 产生相同的粘性末

11、端， 产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶 同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将 同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将 DNA 这类末端连接起来， 这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破 坏。 Your company slogan 如Xba1和Nhe1: T|CTAGA3 5T|CTAGA 3 T|CTAGA AGATC|T5 3AGATC|T 5 AGATC|T CTAGA3 5T T CTAGA 3 T5 3AGATC AGATC T 5 G|CTAGC3 5G|CTAGC 3 G|CTAGC CGATC|G5 3CGATC|G 5 CGATC|G CTAGC3 5G G CTA

12、GC 3 G5 3CGATC CGATC G 5 TCTAGC3 5TCTAGC 3 TCTAGC AGATCG5 3AGATCG 5 AGATCG 这些粘性末端连接后， 这些粘性末端连接后，Xba1和Nhe1酶将不 能再切割， 1(酶切识别位点为 能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为 GATC)来进行再切割 来进行再切割。 GATC)来进行再切割。 Your company slogan 二、DNA连接酶 DNA连接酶 催化双链DNA一端的3 OH与 催化双链DNA一端的3OH与 DNA一端的 另一双链DNA5 DNA5的磷酸根形成 另一双链DNA5 的磷酸根形成 磷酸二酯键， 3，

13、5-磷酸二酯键，使具有 相同粘性末端或平末端的DNA DNA末 相同粘性末端或平末端的DNA末 端连接起来。 端连接起来。 Your company slogan 三、DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶(DNA 聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段） 大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段） DNA聚合酶 片段 Your company slogan DNA聚合酶的 DNA聚合酶的3种功能 聚合酶的3 聚合酶功能 3 5 功能 5 外切功能 3外切 Your company slogan DNA聚合酶活性 53DNA聚合酶活性 DNA

14、聚合酶 5 CCG 3 GGCTATCGA5 dATP dTTP dGTP dCTP 5 CCGATAGCT3 CCGATAGCT3 3 GGCTATCGA5 Your company slogan 35外切酶活性 5 CCGATAGCT3 CCGATAGCT3 3 GGC5 聚合酶 5 CCG3 3 GGC5 A T A G C T Your company slogan Klenow片段从大肠杆菌DNA聚合酶I中去除53 外切酶活性，即得Klenow片段。其只具有 53聚合酶活性 Your company slogan Taq DNA聚合酶 特性： 耐热的DNA聚合酶 来自于嗜热的栖热水生

15、菌Thermus aquaticus 中纯化而来的。 53聚合酶活性 53外切酶活性 最佳作用温度为75-80C Your company slogan 载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒 (vector)主要包括 (plasmid)、噬菌体(phage) 病毒(virus)三大类。 (phage)和 (virus)三大类 (plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。 这些载体均需经人工构建，除去致病基因， 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋 予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、 予一

16、些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、 单一的限制酶切点等。 单一的限制酶切点等。 Your company slogan 质粒载体 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的 双链环状DNA，具有独立复制的能力， 独立复制的能力 双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌 抗药基因。 最早使用的质粒DNA是人工构建的 的抗药基因。 最早使用的质粒DNA是人工构建的 pBR322，该质粒分子大小为4.3kb， pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素 和抗氨苄青霉素基因， EcoR BamH 和抗氨苄青霉素基因，含EcoR，BamH， Hind等单一的限制酶切点。

17、Hind等单一的限制酶切点。 Your company slogan 目 Your company slogan 录 质粒载体的特征 1.自主稳定复制 松弛型质粒 2.具有多种限制性内切酶酶切位点 2.具有多种限制性内切酶酶切位点 3.遗传标记 3.遗传标记 4.插入容量大 4.插入容量大 5.分子量小 分子量小， 5.分子量小，拷贝多 6.安全 6.安全 Your company slogan 目前常用商用载体 pJLA50X系列 pcDNAII; etc 系列 pET系列 (T7 promoter, Novagen公司 公司) 系列 公司 pQE系列 (T5 promoter, Qiage

18、n公司 公司) 系列 公司 pMAL系列 (周质表达 BioLabs公司 周质表达, 公司) 系列 周质表达 公司 pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) 融合表达 公司 pBAD系列 (Arabinose诱导型 诱导型) 系列 诱导型 Your company slogan Your company slogan 二、原核表达载体的构建 1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 重组DNA DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选 6. 克隆基因的表达

19、Your company slogan Your company slogan 目的基因的获取目的基因是人们所需要转移或改造的基因。 目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云 金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（ 金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病 毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及 抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因， 人的胰岛素基因、干扰素基因等。获取目的基因 人的胰岛素基因、干扰素基因等。 的方法有 1.从染色体DNA中分离 2.人工合成 1.从染色体DNA中分离 2.人工合成 从染色体DNA 3.从mRNA合成 3.从mRNA合成cDNA 合成cDNA 4.基因文库

20、 4.基因文库 Your company slogan 双酶切 Your company slogan 连接反应 Your company slogan 重组体的转化 1. 重组体导入大肠杆菌 （1）氯化钙法 （2）电击法 （3）体外包装法 2. 重组体导入哺乳动物细胞 （1）磷酸钙共沉淀法 （2）脂质体介导法 （3）病毒感染法 （4）显微注射法 Your company slogan DNA重组体的筛选与鉴定 DNA重组体的筛选与鉴定 1.目的基因检测 1.目的基因检测 2.DNA限制酶切图谱分析 2.DNA限制酶切图谱分析 3.根据重组载体的表型进行筛选 3.根据重组载体的表型进行筛选 4

21、.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定 4.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定 Your company slogan 常见注意事项 1.载体的选择 1.载体的选择 2.酶切位点的选择与克隆引物的设计 2.酶切位点的选择与克隆引物的设计 3.酶切反应的设计 3.酶切反应的设计 4.酶切实验 4.酶切实验 5.连接比例的设置 5.连接比例的设置 6.连接温度与时间 6.连接温度与时间 7.感受态细胞的制备 7.感受态细胞的制备 8.转化 8.转化 9.重组子的鉴定 9.重组子的鉴定 Your company slogan 载体的选择标准 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定 具有两个以上的

22、遗传标记物， 有多个限制性内酶切位点，至少有两种酶能在同一体系 有多个限制性内酶切位点， 中反应。 中反应。 拷贝数高，表达量高，表达稳定。 拷贝数高，表达量高，表达稳定。 具有强启动子和相应的表达标签和蛋白酶位点， 具有强启动子和相应的表达标签和蛋白酶位点，便于表 达产物的鉴定纯化。 达产物的鉴定纯化。 Your company slogan 酶切位点的选择 必须是选定载体的MCS 必须是选定载体的MCS上的两种酶切位点 MCS上的两种酶切位点 尽量选用能产生粘性末端的限制性内切酶位点, 尽量选用能产生粘性末端的限制性内切酶位点,并 且上游酶切位点尽量靠近起始密码子。 且上游酶切位点尽量靠近

23、起始密码子。 目的基因中不能含有选用的酶切位点 两种酶尽可能在同一体系中反应， 两种酶尽可能在同一体系中反应，并且具有相近 的切割效率 为了保证切割效率， 为了保证切割效率，在设计的克隆引物的酶切位 点前面必须加上合适的保护碱基。 点前面必须加上合适的保护碱基。 Your company slogan 酶切反应大多数限制酶贮存在50甘油溶液中，以避免在-20条件下结冰。 大多数限制酶贮存在50甘油溶液中，以避免在-20条件下结冰。 50 条件下结冰 当最终反应液中甘油浓度大于12 12 当最终反应液中甘油浓度大于12时，某些限制酶的识别特异性 降低，从而抑制酶活性。 降低，从而抑制酶活性。因此

24、加入反应的酶体积不超过反应总体 积的10% 10%。 积的10%。 反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大 反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的 DNA底物的浓度不宜太大， 基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散， DNA会形成粘性DNA溶液 基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活 建议酶切反应的基因组DNA浓度为0 DNA浓度为 ug/ul。同时RNA RNA应 性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。同时RNA应 该尽量消化去除。 该尽量消化去除。 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时 必须选择好通用

25、缓冲液， 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液， DNA 则两种酶才可同时切割。 则两种酶才可同时切割。 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml BSA，可维持酶的稳定性。 0.1mg/ml的 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。 酶切底物DNA应具备一定的纯度，如果溶液中含有迹量酚、氯仿、 DNA应具备一定的纯度 酶切底物DNA应具备一定的纯度，如果溶液中含有迹量酚、氯仿、乙 大于10mM EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度 10mM的 以及过量的盐离子浓度， 醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，都会不同程 度影响限

26、制酶的活性。 度影响限制酶的活性。 Your company slogan 连接反应 连接比例的设置 连接比例目的基因与载体量3：18 ： 1，具体比例按 照跑胶条带的亮度与宽度设计。 经验公式： n（L1K1M2/L2K2M1）=1 (1n10) L1,K1,M1为目的基因的亮度，宽度，分子量，对应的为 载体的。如果超出范围按极值计算。 连接在16，1216h. Your company slogan 实例分析 此时目的条带与载体亮度比 宽度比为2： ， 为1.5：1 ，宽度比为 ：1， ： 目的条带600碱基， 目的条带 碱基， 碱基 载体按6000算，算出比例约为 ：3，根据总 载体按

27、算 算出比例约为10： ， 体积为20ul,则加 则加13ul基因，4ul载体，2ul连 基因， 载体， 体积为 则加 基因 载体 连 接buffer,1ul酶。 酶 Your company slogan 转化 热击温度， 热击温度，时间 42, 90s 这里温度与时间一定要控制精确 转化体系 连接产物不能超过体系总体积的 连接产物不能超过体系总体积的1/5 对照设置 初次做克隆，建议设置双对照，阴性对照： 初次做克隆，建议设置双对照，阴性对照：以切开 的质粒作为连接产物进行转化。阳性对照： 的质粒作为连接产物进行转化。阳性对照：以载 体质粒作为对照 Your company slogan

28、阳性克隆的鉴定 菌落PCR鉴定 菌落PCR鉴定 对于大肠杆菌而言，一般10 16h基本能长出克隆 超过16h 10基本能长出克隆， 16h长出的小菌落 对于大肠杆菌而言，一般10-16h基本能长出克隆，超过16h长出的小菌落 或者卫星菌落一般不是重组子。 或者卫星菌落一般不是重组子。 连接产物生长的菌落一般不是很多，如果平板中菌落数非常多，可能是 连接产物生长的菌落一般不是很多，如果平板中菌落数非常多， 载体酶切不完全，自连严重。也有可能是污染。 载体酶切不完全，自连严重。也有可能是污染。 挑取克隆的时候以在规定时间范围内长出的单一菌落为主， 挑取克隆的时候以在规定时间范围内长出的单一菌落为主

29、，最好不要在 菌落丛生很密的区域挑取克隆。 菌落丛生很密的区域挑取克隆。 挑取的克隆至小管培养4 5h,即可以用菌液做模板进行菌落PCR鉴定 即可以用菌液做模板进行菌落PCR鉴定。 挑取的克隆至小管培养4-5h,即可以用菌液做模板进行菌落PCR鉴定。 双酶切鉴定 菌落PCR鉴定为阳性的克隆要进一步小提质粒做双酶切鉴定。 PCR鉴定为阳性的克隆要进一步小提质粒做双酶切鉴定 菌落PCR鉴定为阳性的克隆要进一步小提质粒做双酶切鉴定。对于插入片 段小的酶切鉴定，酶切时间不要太长， 3h足够 足够。 段小的酶切鉴定，酶切时间不要太长，2-3h足够。防止切下的小片段 弥散。 弥散。 Your compan

30、y slogan 示例图片 Your company slogan 表达鉴定 经过菌落PCR鉴定和双酶切鉴定的重组子， PCR鉴定和双酶切鉴定的重组子 经过菌落PCR鉴定和双酶切鉴定的重组子，一定要进 行最后的表达鉴定。 行最后的表达鉴定。只有看到与预期大小相近的 蛋白表达，原核载体的构建才算成功。 蛋白表达，原核载体的构建才算成功。 将菌落PCR 双酶切鉴定为阳性的克隆子， PCR， 将菌落PCR，双酶切鉴定为阳性的克隆子，提质粒转 化至表达工程菌中， BL21，然后诱导表达， 化至表达工程菌中，如BL21，然后诱导表达，PET 系列载体使用的是T7启动子，使用IPTG诱导。 T7启动子 I

31、PTG诱导 系列载体使用的是T7启动子，使用IPTG诱导。 SDS-PAGE鉴定 鉴定。 SDS-PAGE鉴定。 以未诱导作对照，以分子量marker作为大小鉴定。 marker作为大小鉴定 以未诱导作对照，以分子量marker作为大小鉴定。 确定目的蛋白的表达。 确定目的蛋白的表达。 Your company slogan 蛋白质表达策略 1. 可溶性表达 A: 优化表达条件实现可溶性表达 降低诱导温度， 降低诱导温度，振摇速度 降低诱导物浓度 培养基中添加促溶物质 B: 融合表达 采用NusMBD、GST、thioredoxin融合表达 采用NusMBD、GST、thioredoxin融合

32、表达 C: 选择适宜宿主菌 采用Origami， 采用Origami，Rosetta 等宿主菌 D: 周质腔表达 CBD融合 (pET36/37)、Dsb融合 CBD融合 (pET36/37)、Dsb融合 (pET39/40) 采用带pelB/ompT引导肽的载体 采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22) 引导肽的载体(pET12/20/22) 采用带MBD融合 (pMAL载体 载体, SUMO融合 采用带MBD融合 (pMAL载体, Biolabs) 、SUMO融合 Your company slogan 2. 包涵体表达 并不是所有蛋白都能在大肠杆菌中实现可溶性表达， 并不是所有蛋白都能在大肠杆菌中实现可溶性表达，绝大多数真核蛋白 在大肠杆菌中是以包涵体形式存在的。 在大肠杆菌中是以包涵体形式存在的。 包涵体表达有以下优点 表达量高 表达产物对宿主细胞没有毒性 表达条件不苛刻 Your company slogan Your company slogan 主要内容 1 基因工程及其应用 原核表达载体的构建 蛋白质的诱导与表达 常见问题以及解决