实验一 真核生物基因组DNA的提取和分析.pptx

实验一 真核生物基因组DNA的提取和分析.pptx

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实验室规则,

（一）保持实验室安静，认真仔细地按实验指导进行实验。

（二）穿戴好实验服。

保持实验台的清洁整齐。

（三）爱护仪器，谨慎使用。

节约使用药品试剂，蒸馏水，自来水和电。

（四）不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛洒在实验台上。

（五）公用物品用毕放回原处，不得私自占有。

（六）取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕放回原处。

（七）加热、用电，使用剧毒腐蚀试剂应注意安全操作，避免事故。

（八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。

动物尸体应放入指定的容器中。

（九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。

（十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用物品，将仪器洗净收起。

檫净实验台，请指导教师检查，允许后方可离开。

实验报告,实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列顺序写出实验报告：

实验报告首页：

实验名称（Thetitleofexperiment）；姓名；学号；班级；组别；同组同学；带教教师；实验日期等。

正文：

原理（Principle）；操作步骤（Operationalprocedure）；实验结果（Results）：

包括照片、原始数据、计算过程及图表等；讨论（Discussion）：

对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。

成绩评分标准,50%实验+50%理论考试实验课8次，实验报告，实验表现（包括迟到早退，着装规范，实验操作规范，实验室卫生值日等），8次实验总分最后按比例计入总成绩。

实验报告存档，不归还。

理论考试内容来自于讲义及平时教学。

第八次设计性实验课安排,分组方案：

4人一组（无法组队同学加入其它组）答辩ppt内容：

实验目的，意义，原理，实验方法选择，预计结果及数据表现形式实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释答辩安排：

最后一周答辩，每组时间控制为20分钟演讲，10分钟提问。

设计性实验题,免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定。

人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。

蛋清中溶菌酶的分离鉴定。

小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。

如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？

如何提取真核细胞中的线粒体基因组DNA？

请设计实验从基因及蛋白表达角度讨论老年痴呆症模型小鼠与人类老年痴呆症的可比较性（即小鼠模型建立的可靠性）请设计实验从基因及蛋白表达角度追踪老年痴呆模型小鼠发病期典型变化，及给药治疗后效果评价蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设计实验检测羧肽酶A1酶原（procarboxypeptidaseA1）和白蛋白（Albumin）并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。

细胞色素氧化酶（Cytochromeoxidase）在肝脏中有三种亚型，即细胞色素氧化酶1，2和3，请以实验小鼠肝脏为材料设计实验检测这三种酶的表达并计算它们的表达量。

实验一、真核生物基因组DNA的提取和含量测定,一、实验背景,高等生物的基因组很大。

比如人细胞基因组约含3万个结构基因。

基因组包含了人生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量。

研究的起点就是要获得高纯度基因组DNA不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好以便有足够量用于分析；基因组相对完整不断裂的基因组以便用于以后PCR分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。

人体一个细胞基因组DNA有多长度？

人基因组有多大？

人体有多少细胞？

二、实验目的掌握小鼠肝脏基因组DNA的提取技术学习DNA定性、定量分析的原理和技术三、实验内容第一部分：

小鼠肝组织DNA的提取第二部分:

紫外分光光度法分析DNA纯度第三部分：

二苯胺法分析DNA含量和纯度四、主要试剂五、实验步骤,一、核酸提取的主要步骤真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步:

破碎细胞去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞基因组较大，在纯化出的DNA的操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA沉淀核酸,乙醇沉淀,二苯胺法紫外分光光度法分析,SDS裂解蛋白酶K消化酚氯仿抽提,DNA提取和分析步骤图解,二、各种试剂的作用,1、裂解液：

成分：

N:

NaCl150mME:

EDTA.Na225mM（PH:

8.0）作用：

金属离子螯合剂，抑制DNase的活性（螯合DNase发挥活性所需的2价阳离子）。

2、SDS：

十二烷基硫酸钠终浓度0.5%作用：

a.阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分b.使蛋白质变性c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用3、蛋白酶K（或链霉蛋白酶）作用：

广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。

作用：

去除蛋白等杂质。

酚对蛋白有强烈的变性作用，可使样品中的蛋白质变性，通过离心去除。

为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。

成分：

重蒸酚:

酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。

无色酚的氧化产物（如醌等,粉红色）破坏磷酸二脂键。

重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。

TE溶液:

Tris-HCl10mM（pH:

8.0）EDTA.Na21mM（pH:

8.0）作用：

提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。

在酸性条件下，DNA分配于有机相。

8-羟基喹啉：

0.1%黄色酚相指示剂抗氧化剂,4、苯酚：

5、酚/氯仿,氯仿作用：

氯仿的变性作用不如酚好，但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果；氯仿有加速有机相和水相的分离、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；6、氯仿/异戊醇（24:

1）氯仿的作用：

去除DNA水溶液中残留的微量酚。

异戊醇的作用：

降低表面张力，减少操作过程中气泡的产生。

作用：

提供单价阳离子，中和DNA分子表面的负电荷，使得DNA容易聚集8、无水乙醇：

在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA发生沉淀。

核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。

最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等常用有机沉淀剂有：

乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等,7、醋酸钠：

3MNaAcpH:

5.2,注意事项：

本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我们总是取上清。

；在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头。

基因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作。

离心机使用注意平衡！

【操作步骤】,基因组DNA的提取1组织细胞的裂解切取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次。

当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。

在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组DNA被降解。

碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL分离缓冲液，匀浆（冰上操作）。

匀浆液转入2mL离心管，4,5000rpm离心5min；沉淀加0.4mL无菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液（含100g/ml的蛋白酶K），慢慢颠倒混匀，50保温90分钟,直到组织完全解体。

加10mg/ml的RNase16l（终浓度200g/ml），37保温40min。

2裂解物中蛋白质的去除,加等体积酚/氯仿/异戊醇（25:

24:

1），慢慢颠倒混匀，冰上静置5min。

待分层后,于4，12000rpm离心15min。

离心后可见分层，上层为水相含DNA，下层为有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。

小心吸出上面的水层并转移到新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:

24:

1），重复上述操作以去除蛋白质，直至界面不再出现明显的变性蛋白质为止。

小心吸出上面的水层并转移到另一新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀。

4，12000rpm离心15min。

本步骤可去除微量的酚。

3DNA的沉淀,1）上清加1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。

室温下静止10分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。

10000rpm离心10min，弃上清。

2）DNA沉淀溶解于3mlTE中，进行260nm/280nm紫外检测。

核酸定性定量检测,核酸的含量可以用定磷法、定糖法和紫外分光光度法来测定。

定磷法是利用核酸分子中磷的含量相对恒定这一性质来测定核酸的含量，该法测定的结果较准确（RNA、DNA中磷的质量分数的平均值分别为9.5%9.9%）；定糖法中的二苯胺法测定DNA的含量紫外分光光度法测定核酸较为方便，但误差较大。

二苯胺显色法测定DNA含量,【基本原理】DNA在酸性条件下加热，酸解释出脱氧核糖。

脱氧核糖在酸性环境中脱水生成-羟基-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收。

在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

除脱氧核糖外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。

其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。

实验流程,DNA标准溶液取14支试管，分成7组，其中五组依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mLDNA标准溶液,用于绘制DNA标准曲线,实验流程,待测DNA溶液H2O水DNA标准溶液,另取2支试管，各加2mL蒸馏水作为对照。

2支试管，加2ml待测DNA溶液,用于绘制DNA标准曲线,实验流程,二苯胺待测DNA溶液H2O水DNA标准溶液然后各加入4mL二苯胺试剂，混匀,用于绘制DNA标准曲线,于100恒温水浴中保温20分钟，冷却后于595nm处进行比色测定。

取两管平均值，以DNA含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

DNA含量的计算根据测得的光吸收值，绘制标准曲线，从标准曲线上查出相当该光吸收值的DNA的含量。

紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度,【基本原理】1紫外分光光度法测定核酸含量：

由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50g/ml双链DNA。

2紫外分光光度法测定DNA纯度：

由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰。

DNA纯品的A260/A280为1.8（1.71.9），故根据算A260/A280的值可以估计DNA的纯度。

若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。

【操作步骤】,用TE缓冲液稀释样品（520倍），用TE缓冲液调零点，样品稀释液转入紫外分光光度计的石英比色杯中，分别测定其在260nm和280nm的吸光度。

吸光度在0.21.2OD范围内较为理想。

计算浓度：

双链DNA样品浓度（g/l）=A260核酸稀释倍数50/1000计算A260/A280比值，分析纯度。

移液器的使用及注意事项1、用途,2、使用2.1根据取样量，选择合适的加样器。

5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器?

顶部标有加样器的最大量程，分别为：

顺时针调节-读数变小逆时针调节-读数变大注意：

调节前加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。

练习：

加样器读数为100，实际体积各为多少?

移液器的调节,

（1）首先观察目前读数,假设为050:

移液器使用步骤,选择加样器,观察读数,调节读数，吸头的安装要紧密。

不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下吸取液体前，先打到第一挡。

将吸头插入液面下适当深度，过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。

缓慢松开拇指,吸取液体。

松开过快，液体上冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒钟,急于离开液面，容易吸入空气。

抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去6）（吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！

）贴容器内壁，