成年饲料鸡肠道正常菌群的检测生物科学本科生毕业论文.docx
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成年饲料鸡肠道正常菌群的检测生物科学本科生毕业论文
成年饲料鸡肠道正常菌群的检测-生物科学本科生毕业论文
本科生毕业论文（设计）
题目：
成年饲料鸡肠道
正常菌群的检测
学生姓名：
xx
学号：
xx
专业班级：
生物科学10103班
指导教师：
xx老师
完成时间：
2014年5月1日
成年饲料鸡肠道正常菌群的检测
生物科学专业：
xx
指导老师：
xx
摘要：
从健康的成年饲料鸡肠道前段、中段、后段分离细菌30株。
革兰氏染色结果表明：
24株为革兰氏阴性菌，6株为革兰氏阳性菌。
研究了他们产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶的能力。
结果表明：
本次实验从健康的成年饲料鸡肠道分离得到的30株菌中，21株都产蛋白酶，占菌株总数的75%，产脂肪酶的有18株，占总数的60%，产淀粉酶的有12株，占总数的40%，产纤维素酶的有9株，占总数的30%。
其中产4种酶的有1株，产3种酶的有8株，产2中酶的有13株。
产一种酶的有6株。
关键词：
鸡肠道，蛋白酶，脂肪酶，纤维素酶，淀粉酶
Adultchickenfeeddetectionofintestinalnormalflora
Student:
LiuHengjia
Advisor:
LiNa
Abstract：
Fromhealthyadultchickenfeedfront,middle,afteraperiodofseparationofintestinalbacteria30strains.Gramstainingresultsshowedthat24strainsofgram-negativebacteria,6strainsofgram-positivebacteria.Theyproduceprotease,amylase,lipaseandcellulase.Resultsshowthatthisexperimentfromthehealthyadultinintestinal30strainsofbacteriawereisolatedfromfeedchicken,21strainsproducingprotease,accountingfor75%ofthetotalnumberofstrains,thereare18strainsoflipaseproduction,accountingfor60%ofthetotal,therewere12strainsproduceamylase,accountingfor40%ofthetotal,producecellulasehas9strains,30%ofthetotal.Amongthemoneoffourkindsofenzymeproduction,eightstrainsofthethreekindsofenzymeproduction,have13of2enzymeproduction.Toproduceanenzymehas6strains.
Keywords:
Chickenintestine,protease,lipase,cellulase,amylase
1引言
鸡（Chicken）属鸡形目雉科原鸡属红原鸡亚属。
鸡是人类饲养最普遍的家禽。
家鸡源出于野生的原鸡，其驯化历史至少约4000年，但直到1800年前后鸡肉和鸡蛋才成为大量生产的商品。
鸡的种类有火鸡、乌鸡、野鸡等。
鸡的种类很多，各地所产的鸡，大小形色都不相同。
鸡的体温在40.9℃与41.9℃之间，平均体温是41.5℃。
雏鸡在养殖时舍温要求比较高，一般在35℃左右。
一只母鸡年平均产蛋300枚左右，平均出雏率在70%以上。
鸡的一般最长存活13年。
每100g可食部分含能量167cal，蛋白质19.3g，脂肪9.4g，水69g，碳水化合物1.3g，维生素A48mg，维生素B
0.05g，维生素B
0.09g，维生素E0.67mg，烟酸5.6mg，钠63.3mg，钙9mg，铁1.4mg，胆固醇106mg。
鸡食性简单，食料来源广，且生长迅速，产量高，是人类饲养最普遍的家禽。
随着鸡养殖大幅度提高，其病害发生也日趋严重，各种病原体的侵袭严重影响了鸡的产量和效益。
而在家禽动物疾病防治过程中，抗生素类的药物作用明显，但是它们可导致耐药性的产生以及耐药因子的传递，残留的药物会通过食物链影响人类的健康等，所以寻求抗生素替代品就愈加重要，益生菌的出现给人们带来了新的希望。
鸡消化道不同部位在营养物质的消化、吸收和肠道健康中发挥着不同的作用。
嗉囊、肌胃和十二指肠的主要功能是消化饲料,空肠和回肠的主要功能是吸收营养物质,盲肠内容物经过大量微生物的发酵,进一步吸收营养成分,去除毒性物质,减少有害微生物数量。
鸡消化道中的大量微生物菌群对其营养、免疫、疾病防治以及生理功能的发挥都要产生重要影响,进而影响鸡的生长和健康。
正常情况下,动物消化道内存在的有益微生物对维持消化道内的菌群平衡、促进动物生长和饲料的消化与吸收起着重要作用。
当环境及饲料投放等过激时会造成动物机体消化道内微生物区系紊乱。
病原菌大量繁殖，引起动物消化机能失调，生长受阻。
本研究旨在研究健康饲料鸡肠道中分离到的几种可以产蛋白酶菌株、纤维素酶菌株、淀粉酶菌株和产脂肪酶的菌株及其分布状况，以期为后续研究工作打下基础。
2材料和方法
2.1实验材料
2.1.1实验动物
饲料喂养的健康鸡个体（数只）
2.1.2实验菌株
大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等。
2.1.3实验试剂与药品
硫酸镁、牛肉膏、氯化钠、磷酸氢二钾、吐温80、中性红水溶液、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂、酪蛋白、磷酸氢二钠、0.4%溴麝香草酚蓝溶液、氯化钙、吐温-80、蒸馏水等。
2.1.4实验器材
高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温干燥箱、冰箱、生物显微镜、电子天平、移液管、胶头滴管、培养皿100、微生物实验常规用具等。
2.2实验方法
2.2.1培养基的配方
FWA培养基：
硫酸镁0.05g，牛肉膏2.50g，氯化钠5.00g，磷酸氢二钾0.20g，葡萄糖1.00g，蛋白胨5.00g，酵母膏2.50g，琼脂15.00g，蒸馏水1000ml，pH为7.2-7.4
测定菌株产蛋白酶的培养基：
酪蛋白10.00g，磷酸氢二钠2.00g，琼脂13.00g，蒸馏水1000ml，0.4%溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，pH为7.2-7.4
测定菌株产脂肪酶的培养基：
蛋白胨5.00g，酵母粉1.00g，氯化钙0.10g，吐温-80为10ml，氯化钠5.00g，琼脂15.00g，蒸馏水1000ml，pH为7.2
测定菌株产纤维素酶的培养基：
蛋白胨10.00g，琼脂10.00g，氯化钠2.50g，胆盐2.50g,乳糖5.00g，1%中性红水溶液2.50g，蒸馏水500ml,pH为7.2
测定菌株产淀粉酶的培养基：
牛肉膏5.00g，蛋白胨10.00g，琼脂10.00g，氯化钠5.00g，淀粉5.00g，pH为7.0-7.2
2.2.2配制培养基
（1）称药品：
将实验所需药品放在滤纸上用电子天平称量，称取后溶解于蒸馏水中倒入大瓷缸。
（2）加热溶解：
在大瓷缸中加入所需水量，然后放在电炉上，小火加热，加热时在瓷缸底部垫石棉网使瓷缸受热均匀。
边加热边用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充蒸馏水至1L。
（3）调pH值：
用玻璃棒从瓷缸中沾取一滴待测滴液涂在pH试纸上，再与比色卡上的颜色对比，若发现瓷缸中的pH值偏碱，用1mol/L的HCl调至所需pH值范围，若发现瓷缸中的pH值偏酸，用1mol/L的NaOH调至所需pH值范围。
（4）分装：
将配置的培养基分装在三角瓶内和试管中，分装时应该避免培养基粘在瓶口而造成污染，且分装量不应该超过三角瓶的2/3.试管中的培养基要适量，不超过试管的2/3适宜。
（5）加棉塞：
棉塞的形状、大小和松紧度要适中，不留缝隙，以防被细菌污染和保持有效的通气。
（6）包扎：
棉塞外包上报纸，纸外用棉绳捆好，防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。
（7）灭菌：
采用的是高压蒸汽灭菌，将带灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，放好垫子，将盖子上与排气孔相连接的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口。
以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，关上排气阀后接通电源，开始加热。
当压力表的指针上升到0.05MPa时，打开排气阀排出锅内冷空气，待压力表指针回到0MPa附近时，关上排气阀，重复上述排冷空气的操作一次，此时锅内的冷空气一般已经排尽，关上排气阀，当压力表指针上升到0.1MPa时开始计时，使指针维持在0.1MPa到0.15MPa之间的时间为30分钟，最后切断电源，使灭菌锅自然冷却，待压力表指针回到0MPa附近时打开排气阀，拧开盖上的螺栓，将锅盖打开小半，利用锅内的蒸汽将包扎的报纸烘干。
之后取出灭菌物品，放入超净工作台。
注：
灭菌过程要注意安全，加水要适量，气垫要放正，防止漏气，注意勿烫伤手。
灭菌后的物品不能将棉塞上的报纸打开，避免外界细菌进入污染培养基和蒸馏水。
试管取出后应该斜放，斜面长度达约为试管长度的1/2。
（8）无菌检查：
将灭菌的培养基放入37℃恒温箱中培养48小时，然后取出观察，培养基上没有细菌生长，说明培养基灭菌效果良好，符合实验要求。
然后将培养基贮存于冰箱的上层，温度控制在4℃.注：
不能将棉塞上的牛皮纸打开，避免细菌进入污染培养基。
2.2.3菌体分离与纯化
（1）取鸡的肠道，将鸡肠道内的粪便等物清除干净。
用手术剪刀不断剪切肠体，用研磨棒将肠研磨成糊状直至没有明显的块状。
于电子秤上准确称取1g肠体放入装有9ml无菌水的试管中震荡，使肠体与无菌水完全混匀，制成原液10
。
然后在无菌操作台中用灭菌过的1ml吸管吸取1ml原液滴入装有9ml无菌水的试管中混匀进行10倍系列稀释，稀释至10
。
在无菌操作台中取其中10
、10
、10
3个适宜浓度梯度的菌悬液各0.1ml于FWA平板上涂匀，每个浓度梯度涂布3个平板，将涂好的平板于40℃下培养48h至菌落长出。
（2）在FWA平板上挑取菌落特征不同的菌落作稀释划线培养，并在相应的平板上标号1~12号，于40℃下恒温培养48h。
（3）倒FWA平板10个，从前面已经培养出来菌落的12个平板中挑选长势相对较好特征不同的10株单个菌落作“Z”字形划线培养。
于40℃下恒温培养48h。
（注：
每个平板上的“Z”线尽可能多，且不用相连，接种时不用灼烧接种环，在每个平板上贴上1~10号10个标签）
（4）取来自同一平板的单个菌落倒好的FWA斜面培养基上作“Z”字形划线，贴上相对应的标签于40℃下培养48h，后置于4℃冰箱中保藏。
（5）菌体纯化：
从鸡肠道中前段，中段，后段各分离12株菌落特征不同的菌株，分别编号1～12，挑取分离出来的36株单个菌落于FWA培养基上作“Z”字形划线，于40℃下纯化培养48h后得到30个菌株。
2.2.4革兰氏染色
（1）涂片：
用消毒棉球擦拭双手，用镊子取30块干净载玻片，在各个载玻片左右两端各滴加一滴蒸馏水，用铂金环取大肠杆菌加于左侧蒸馏水制成的薄薄的菌涂面，做阴性对照。
用铂金环从培养皿中分别挑取标号为1～30的菌株涂在玻片右侧蒸馏水中做成菌涂面。
（2）晾干：
将涂片放在通风处自然晾干或在酒精灯火焰上方文火烘干。
（3）固定：
手执玻片一端，菌膜朝上，通过火焰2~3次进行固定，以不烫手为宜。
（4）结晶紫初染色：
将玻片置于废液缸搁架上，加适量的结晶紫染色液染色1min（以盖满菌落涂面为宜），然后倾去染色液，用蒸馏水小心地冲洗。
（5）碘液媒染：
滴加卢哥氏碘液，媒染1min后用蒸馏水洗去碘液。
（6）脱色：
将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇，脱色20s直至流出液无色，立即用蒸馏水冲洗。
（7）复染：
滴加番红复染3min，再用蒸馏水洗去涂片上番红染色液。
（8）晾干：
将染好的涂片放在空气中自然晾干或用吸水纸吸干。
（9）镜检：
先用低倍镜后用高倍镜，最后用油镜观察，并判断以及记录菌体的革兰氏染色反应性，结果见表1。
2.2.5菌株筛选
2.2.5.1产蛋白酶菌株的筛选
本实验选用酪蛋白作为底物，菌落长出之后,若菌落四周出现透明的水解圈，说明该菌株能产生蛋白酶，水解培养基中的酪蛋白。
蛋白酶筛选培养基接种后于40℃下培养48h。
菌株分泌蛋白酶能力的大小，可以通过比较水解圈直径：
菌落直径数值来判断，该值越大，菌株产蛋白酶能力越强。
2.2.5.2产脂肪酶菌株的筛选
产脂肪酶菌株的筛选培养基中含有Tween-80，它对脂肪酶的产生有促进作用。
经接种后，若培养基上菌落周围出现模糊的晕圈者，说明该菌株能产脂肪酶。
菌落形成晕圈直径：
菌落直径越大，表明此菌株产生的脂肪酶的量和能力都相对较强。
菌株接种后置于40℃下培养48h后观察结果。
2.2.5.3产淀粉酶菌株的筛选
产淀粉酶菌株的筛选培养基中是以淀粉作为碳氮源进行培养，若接种之后培养基表面长出菌落，说明该菌株能产生淀粉酶，水解培养基中的淀粉作为生长的碳氮源。
淀粉筛选培养基接种后于40℃下培养48h。
然后往培养基中菌落表面滴加稀碘液，可以看见明显的水解圈。
菌株产淀粉酶能力的大小可以通过比较水解圈的直径大小来判断，若直径越大，则说明该菌株产淀粉酶的能力越强。
2.2.5.4产纤维素酶菌株的筛选
产纤维素酶菌株的刷选培养基中含有1%的中性红水溶液，它能促进菌落产生纤维素酶，经过接种之后放在40℃下培养48h，若培养基表面长出菌落并且菌落周围出现模糊的晕圈者，说明该菌株能产生纤维素酶。
菌株产纤维素酶能力的强弱可以通过比较菌落和晕圈的大小来判断。
若菌落越小，晕圈越大说明该菌株产纤维素酶的能力越强。
3结果与分析
3.1菌种分离纯化与革兰氏染色
从健康的饲料鸡肠道前段、中段、后段分离出细菌12株，依次编号为1～12号。
革兰氏染色结果表明饲料鸡肠道36株菌株中前段的6号、10号、后段的3号、10号、12号菌株为革兰氏阳性菌，其余23株为革兰氏阴性菌，有8株为无效菌株。
详情见表1。
表1菌落形态特征与革兰氏染色结果分析
Table1colonymorphologycharacteristicsandresultsofgram’sstaining
菌株编号形态特征革兰氏染色
前段1很小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
前段2较大，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
前段3大，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
前段4一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，透明G-
前段5较大，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
前段6较大，堆积，表面凸起，边缘不整齐，湿润，光泽，白色，透明G+
前段7一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
前段8很小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
前段9较大，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
前段10大，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G+
前段11很小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
前段12较小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段1较小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段2较小，堆积，表面凸起，边缘不整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段3很小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段4较大，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段5很小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段6较大，堆积，表面凸起，边缘不整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段7很小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段8一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
中段9很小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段10较大，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
中段11很小，堆积，表面凸起，边缘不整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
中段12一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
后段1一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
后段2一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
后段3一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G+
后段4小，堆积，表面凸起，边缘不整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
后段5大，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，深黄色，不透明G-
后段6较小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
后段7很大，堆积，表面凸起，边缘不整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
后段8一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
后段9较小，堆积，表面凸起，边缘不整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G-
后段10一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G+
后段11一般，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，淡黄色，不透明G-
后段12很小，堆积，表面凸起，边缘整齐，湿润，光泽，黄色，不透明G+
[注]：
表中G-代表革兰氏阴性菌，G+代表革兰氏阳性菌，-代表无效的菌株。
3.2产蛋白酶菌株的筛选
从饲料鸡肠道中用FWA培养基培养之后分离出来30株菌株，经实验培养测试，其中有21株能分泌蛋白酶。
其中前段12347中段2356710后段2348号共15株菌株不能产蛋白酶。
其中产蛋白酶能力最强的是鸡肠道后段的12号菌株，其水解圈大小为1.10cm，D:
d为3.67，其次为中段8号菌株。
其中前段11号、后段1号、9号、10号菌株的产蛋白酶能力也很强。
其中产蛋白酶能力较弱的是中段4号菌株，其D:
d为1.50。
详情请见表2。
表2饲料鸡肠道中产蛋白酶的菌株
Table2feedthechickenintestinesmiddleproteasestrains
菌株菌落直径水解圈直径D:
d
编号〔d〕/cm〔D〕/cm
饲前50.200.452.25
饲前60.150.402.67
饲前80.150.352.33
饲前90.300.752.50
饲前100.300.802.67
饲前110.250.803.20
饲前120.350.702.00
饲中10.400.852.13
饲中40.300.451.50
饲中80.351.253.57
饲中90.300.702.33
饲中110.250.702.80
饲中120.150.402.67
饲后10.150.453.00
饲后50.150.402.67
饲后60.250.502.00
饲后70.050.102.00
饲后90.100.303.00
饲后100.200.653.25
饲后110.250.602.40
饲后120.301.103.67
[注]：
表中数据按照四舍五入原则精确到小数点后2位。
（下面所有表格相同。
）
图1鸡肠道中产蛋白酶的菌株
Picture1intestinalproteaseproducingstrainsinthechicken
3.3产脂肪酶菌株的筛选
从鸡肠道中分离出来的菌株中总共有18株菌株能分泌脂肪酶，其中鸡肠道前段7号中段1、2、3、5、6、7、8、10号以及后段1、2、3、4、5、6、9、10、12等18株菌株不能分泌脂肪酶。
产脂肪酶能力最强的菌株是饲料鸡肠前段2号，水解圈直径为1.40cm，D:
d为7.00；其次为中段12号菌株，D:
d为5.33；另外前段4号、11号产脂肪酶的能力也不错。
产脂肪酶能力较弱的菌株为前段9号、中段11号、后段7号、11号等菌株。
详情请见表3。
表3鸡肠道中产脂肪酶的菌株
Table3strainsofintestinallipaseinthechicken
菌株菌株直径晕圈直径D:
d
编号〔d〕/cm〔D〕/cm
饲前10.551.302.36
饲前20.201.407.00
饲前30.250.502.00
饲前40.150.704.67
饲前50.250.803.20
饲前60.200.753.75
饲前80.100.303.00
饲前90.450.551.22
饲前100.451.302.89
饲前110.351.404.00
饲前120.350.902.57
饲中40.250.853.40
饲中90.150.453.00
饲中110.150.251.67
饲中120.150.805.33
饲后70.100.151.50
饲后80.050.102.00
饲后110.150.251.67
图2鸡肠道中产脂肪酶的菌株
Picture2chickenintestinemiddlelipasestrain
3.4产纤维素酶菌株的刷选
此次从鸡肠道分离出来的细菌中有10株能分泌纤维素酶，其他的26株菌株不能产生该酶。
产酶能力最强的是鸡肠道中段的11号菌株，其水解圈大小为0.25cm，D:
d为2.50。
其中肠道前段的3号、12号以及中段的9号菌株产纤维素酶的能力不错，它们的D:
d大小都在2.00左右。
在这些产纤维素酶的菌株中，鸡肠道12号以及后段10号菌株产纤维素酶的能力较弱，D:
d大小为1.50。
见表4。
表4鸡肠道中产纤维素酶的菌株
Table4chickenintestinemiddlecellulasestrains
菌株菌株直径晕圈直径D:
d
编号〔d〕/cm〔D〕/cm
饲前30.150.302.00
饲前50.150.251.67
饲前90.200.351.75
饲前120.150.352.33
饲中60.150.251.67
饲中90.150.302.00
饲中110.100.252.50
饲中120.200.301.50
饲后50.150.251.67
饲后100.100.151.50
图3鸡肠道中产纤维素酶的菌株
Picture3chickenintestinemiddlecellulasestrains
3.5产淀粉酶菌株的筛选
经实验证明，从鸡前、中、后三段肠道分离出来的36株菌株中能够分泌淀粉酶的菌株共有12株，占总的33.3%。
余下的24株菌株不能分泌淀粉酶，占总数的66.7%。
产酶菌株当中鸡肠道中段
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