GCMS测定三种不同蒿属植物挥发性物质.docx
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GCMS测定三种不同蒿属植物挥发性物质
学号：
071040219
本科生毕业论文
SPME-GC/MS测定三种不同蒿属植物
挥发性物质
院（系）：
生物科学与技术学院
姓名：
付伟
班级：
0710402班
专业：
生物工程
指导教师：
周毅峰副教授
中国·恩施
二〇一四年五月
ID:
071040219
BACHELOR'STHESISOFHUBEIUNIVERSITYFORNATIONALTIES
DeterminationofthreekindsofdifferentArtemisiavolatilesubstanceSPME-GC/MS
Name:
FuWei
Grade:
071040219
Profession:
Biologicalengineering
Tutor:
ZhouYi-feng
Enshi•China
May,2014
学术声明
1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。
2、本论文是我个人在导师指导下进行的研究取得的学术成果。
3、本论文中除引文外，所有试验、数据和有关材料均是真实的。
4、本论文中除注明作者和来源的引文外，不包含其他人、其他机构已经发表或撰写过的研究成果。
5、其他同志对本研究所做的贡献已在论文中做了声明并表示了谢意。
6、本声明的法律后果由本人承担。
作者签名：
年月日
导师审核声明
本人郑重声明：
该生所呈交的学位论文，是在本人的指导下独立进行研究工作所取得的成果。
其中文字、图、表及其它相关内容均经本人审核，同意作为该生的学位论文提交。
导师签名：
年月日
SPME-GC/MS测定三种不同蒿属植物
挥发性物质
付伟
（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施，445000）
摘要:
为了解艾蒿、臭蒿和黄花蒿三种蒿属植物挥发性物质的组成，探寻其与叶面腺毛体的关系，通过顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用法对其化学成分进行鉴定分析比较，并利用体式荧光显微镜观察三种蒿属植物叶面腺毛体数量。
结果表明：
1）黄花蒿挥发性物质种类和含量最多，艾蒿挥发性物质种类和含量其次，臭蒿挥发性物质种类和含量最少，三者主要成分均为单萜类化合物与倍半萜类化合物；2）三种植物均含有顺-3-己烯酸乙酯、蒈烯、桉树脑、大根香叶烯、β-石竹烯；3）艾蒿挥发性物质还含有罗勒烯、2，6-二甲基-1，5，7-辛三烯-3-羟基、樟脑、β-榄香烯、丁香烯、桉叶稀、杜松烯、E-环氧法尼稀，臭蒿挥发性物质还含有羟基脲、β-蒎稀、β-榄香烯、丁香烯，黄花蒿挥发性物质还含有3-己烯-1-醇、2-辛烯-4-醇、5，5-二甲基-1-乙基-1，3-环戊二烯、邻异丙基甲苯、莰烯、D-柠檬稀、β-蒎稀、E-β-法尼烯。
4）三种植物中黄花蒿挥发性物质种类和含量最多，其腺毛体数量也最多，艾蒿挥发性物质种类和含量其次，其腺毛体数量也处于其次，臭蒿挥发性物质种类和含量最少，其腺毛体数量也最少。
关键词：
艾蒿；臭蒿；黄花蒿；腺毛体；挥发性物质
DeterminationofthreekindsofdifferentArtemisiavolatilesubstanceSPME-GC/MS
FuWei
（Collegeof biological scienceandtechnology, HubeiInstituteforNationalities, Enshi, 445000）
Absract:
InordertoknowthevolatilesubstancesofArtemisiaargyi H.Lév.etVaniot,ArtemisiahediniiandArtemisiaannua L.andtrytoexploreitsrelationshipwiththenumberofglandulartrichomesonleaf.Usingheadspacesolid-phasemicroextractionandgaschromatography-massspectrometrytoanalysisandidentifythechemicalcomponents,andusingtypefluorescentmicroscopetoobservethenumberofglandulartrichome.Theresultsshowthat:
1）thespeciesofArtemisiaannua Lvolatilesubstancesismost,thespeciesofArtemisiaargyi H.Lév.etVaniotvolatilesubstancesissecond,thespeciesofArtemisiahediniivolatilesubstancesisleast.Themainconstituentsaremonoterpenesandsesquiterpene;2）Allcontaincis-Ethyl3-hexenoate,karen,Cineole,Germacrene,β-Caryophyllene;3）ArtemisiaargyivolatilesubstancesalsocontainsOcimene,2,6-Dimethyl-1,5,7-octatriene-3-ol,DL-Camphor,β-Elemene,Caryophyllene,π-selinene,Cadinene,E-β-Farnesene，ArtemisiahediniivolatilesubstancesalsocontainHydroxycarbamide，β-pinene,β-Elemene,Caryophyllene,Artemisiaannua L.volatilesubstancesalsocontains3-Hexen-1-ol,2-Octen-4-ol,
1-isopropyl-2-methylbenzene,β-pinene,D-limonene,5,5-dimethyl-1-ethyl-1,3-cyclopentadiene,Camphene,E-β-Farnesene.4）ThespeciesandcontentsofvolatilesubstancesandglandulartrichomesofArtemisiaannuaL.aremost;ThespeciesandcontentsofvolatilesubstancesandglandulartrichomesofArtemisiaargyiaresecond;ThespeciesandcontentsofvolatilesubstancesandglandulartrichomesofArtemisiahedinii.areleast.
Keywords:
Artemisiaargyi H.Lév.etVaniot;Artemisiahedinii;Artemisiaannua L.；glandulartrichomes;volatilesubstances
1文献综述1
1.1艾蒿的生物学特性1
1.2臭蒿的生物学特性1
1.3黄花蒿的生物学特性2
1.4蒿属植物挥发性物质研究2
1.5研究意义3
2材料与方法5
2.1材料与设备5
2.2.1材料5
2.2.2设备5
2.2GC-MS条件5
2.3方法5
2.3.1体式荧光测定三种蒿属植物的腺毛体数5
2.3.2三种蒿属植物挥发性物质测定5
3结果与分析7
3.1三种蒿属植物叶片形态观测7
3.2三种蒿属植物挥发性成分测定8
4讨论10
参考文献10
致谢13
附件14
1文献综述
1.1艾蒿的生物学特性
艾蒿（Artemisiaargyi H.Lév.etVaniot）俗名医草、野艾、蕲艾，多年生草本植物或者略成半灌木状，有浓烈香气。
基部木质化而上部为草质，并有少量短分枝，茎枝上覆盖有灰色蛛丝状柔毛。
一回羽状深裂，裂片卵形、卵状披针形或披针形，叶基部宽楔形渐狭成短柄，叶脉明显，在背面凸起；上部叶羽状半裂、浅裂或不分裂，而为椭圆形、长椭圆状披针形、披针形。
瘦果长卵形或长圆形，花果期7-10月。
艾蒿的适应性极强，向阳排水顺畅的地方都可以生长，以湿润肥沃的土壤生长较好，生长在路旁荒野、草地[1]。
主要分布于安徽、广东、湖北、湖南等省，常见于低海拔到中海拔区域的荒地、路旁河边及山坡等地，也见于森林草原及草原地区。
艾蒿的主要药用部位是叶，经大量研究表明其含有挥发油、桉叶烷、黄酮、三萜类及微量化学元素等[2]。
现代药理发现，艾蒿叶含大量挥发油并且为多种化合物的混合物，有脂肪族化合物、芳香族化合物，但更多为萜类衍生物，还含有大量的多酚类物质黄酮，有抗氧化、抑菌、清除自由基等的作用。
对于抗菌作用、利胆作用、对呼吸系统影响等药理方面对艾蒿做了大量研究。
目前各报道中其全草和叶的挥发油主要成分及含量存在较大差异，这可能与艾蒿的种类、生长环境、气候条件、采集时间或者其它因素等有关[3]。
1.2臭蒿的生物学特性
臭蒿（Artemisiahedinii）俗称海定蒿、牛尾蒿、克朗，一年生草本植物，有浓烈的臭味。
茎单生较稀少，高约15—100cm。
叶绿色，背面有腺毛状短柔毛；基生叶多数，羽状分裂，羽状深裂或者全裂；茎下部或者中部为长椭圆形，二回羽状分裂，第一回全裂，每裂叶多有多枚小裂叶，基部稍平展，椭圆形卵状瘦果，一般花期为7—10月。
臭蒿产于内蒙古西南部、新疆南部、四川西部、云南西部等，其中青海和西藏最常见，多分布于海拔2000—5000m地区，多生于湖边、草地、田边、河滩等，局部地区可形成植物群落优势种群或者主要的伴生种。
臭蒿煎剂、去挥发油水浸剂、挥发油等有促进胆汁分泌和利胆作用；对肝脏有影响、可用于治疗肝细胞肿胀、脂肪变、坏死等[4]；对正常体温有明显的降低，具有解热作用；有一定的抗动脉粥样硬化作用，可以降血脂、扩张冠脉及促纤溶；水浸液、挥发油有降血压作用；有抗菌和消炎作用；其对平滑肌有相应的作用；具有促进白细胞分裂、免疫调节和诱生干扰素等作用，可以提高机体免疫功能；还有抗钩端螺旋体、平喘等；幼嫩枝、叶可以作为菜蔬或者酿制茵陈酒，或者可作为家畜的饲料。
在民间入药，有清热、消炎、解毒的功效，主要治疗湿热黄疸、胆囊炎、痈肿毒疮等，还可以作为杀虫药。
1.3黄花蒿的生物学特性
黄花蒿（Artemisiaannua L.）俗称黄蒿、青蒿、草蒿等，一年生草本，有浓烈的挥发性香气。
根单生、垂直、纺锤形；茎单生，有纵棱，幼时为绿色后变为褐色或着红褐色，多分枝；茎、枝、叶、两面及总苞叶背面无毛或者初时背面微有稀疏短微毛，后脱落无毛；茎下叶都为圆形或者三角卵形，绿色，两面有细小脱落性的白色腺点及细小凹点；中部叶二回有羽状深裂，无柄。
果实瘦小，椭圆形或者卵形，交扁，花果期8—11月[5]。
黄花蒿具有极强的环境适应性，常常生长在路边、荒地、山坡等处，局部地区可以形成优势种群或者主要伴生种。
广泛分布于欧洲、亚洲的温带、寒温带以及热带地区，欧洲中部、东部、南部及亚洲北部、中部、东部最多，向南延伸到地中海及非洲北部，亚洲南部、西南部各国；从亚洲北部迁入北美洲、并广泛分布于加拿大以及美国[6]。
黄花蒿富含挥发油、青蒿素、樟脑等，植株地面部分含有东茛菪内脂类化合物。
青蒿素为倍半萜内脂化合物，可治疗各种类型疟疾，具有速效和低毒的特点，对恶性疟及脑疟尤佳。
现已在青蒿素的基础上开发出了多种衍生物，均具有抗疟、抗孕、抗心律失常等作用。
黄花蒿的水煎液对白喉杆菌、炭疽杆菌等有较强的抑菌作用，也有抗流感病毒的作用。
1.4蒿属植物挥发性物质研究
蒿属植物生长环境不同和提取方法不同，挥发性物质及相对含量会出现很大差异，艾蒿、臭蒿、黄花蒿三种蒿属植物中研究较多的为黄花蒿，其挥发性物质主要为萜类及其含氧衍生物，其中单萜及其衍生物和倍半萜及其衍生物最多，还含有小分子脂肪族化合物和小分子芳香族化合物。
挥发性物质大多是无色或着淡黄色，室温就可以挥发，极大多数比水轻，仅少数比水重。
挥发性物质可以随水蒸气蒸馏出来，却很难溶于水，能溶于乙醇、氯仿、脂肪油等，其中某些成分对人类社会发展有着巨大的贡献。
黄花蒿含有大量挥发性物质，化学成分复杂，可分为蒿酮、樟脑、茨烯、丁香烯等成分，因其以烯类为主，故具有芳香气味[7]，如甜没药萜醇、甜没药萜醇氧化物A、甜没药萜醇氧化物B等挥发性物质含量较高，具有灭菌、消炎、愈合溃疡等功能，可用于口腔卫生产品，具有很大的开发和应用价值，也可以作为空气清香剂的主要成分，在医药工业、香料、香精和化妆品中广泛应用。
黄花蒿挥发性物质含有以亚油酸为主的多种脂肪酸，亚油酸是人体必需脂肪酸，与平滑肌收缩、类固醇激素、前列腺素以及其他生命机能有关，还具有颇高保健功能[8]。
黄花蒿挥发性物质具有兰花香味，蒿粉可以作为磨擦剂或着护理剂用以制备牙膏应对口臭、口腔异味，口气倍感清新、持久[9]。
挥发性物质清爽气、芳香味、香气浓郁，可用于化妆品、香皂、香水、空气清新剂等[10]。
含有挥发性物质的中草药或着提取出挥发性物质大多具有止痛、抑菌、矫味等作用，是防暑良药[11]。
1.5研究意义
目前国内外高校和科研机构研究院所对蒿属植物的研究主要在于挥发油、化学成分、药理作用、栽培技术等方面，其中对蒿属植物中的黄花蒿的相关研究最多，却很少将多种蒿属植物中挥发性物质与叶面腺毛体数量联系在一起。
本文采用顶空固相微萃取法在室温条件下利用萃取头对艾蒿、黄花蒿和臭蒿三种蒿属植物挥发性物质进行萃取，然后进行气相色谱—质谱联用分析蒿属植物挥发性物质分析，比较三种蒿属植物挥发性物质的异同点。
实验中对三种蒿属植物叶面腺毛体数量观察，将其与三种蒿属植物叶片挥发性物质联系在一起。
蒿属植物为宝贵的中药材，气相色谱—质谱联用法（GC-MS）可有效地分析蒿属植物挥发性成分，从而探讨蒿属植物的挥发性物质成分及其含量，为艾蒿、臭蒿、黄花蒿的鉴别提供可靠依据，也为其在医药、工业、科研等方面的开发利用提供研究依据和理论指导，对开发利用我国丰富的蒿属植物资源具有重要的现实意义和理论价值，使蒿属植物生物资源的开发利用有一定经济价值和社会效益。
2材料与方法
2.1材料与设备
2.2.1材料
新鲜的采自栽培基地的黄花蒿，校内实习基地采摘的新鲜艾蒿和臭蒿。
2.2.2设备
数显鼓风干燥箱（GZX-9420MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；分析天平（ME204E/02，梅特勒-托利多有限公司）；尼康NikonAZ100型体式荧光DIC成像系统（上海衡浩仪器有限公司）；Agilent6890N/5975C型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；DBV/CAR/PDMS50/30μm萃取头（美国Supelco公司）。
2.2GC-MS条件
色谱条件：
HP-5MS石英毛细管柱（0.25μm×0.25mm×30m）,载气为氦气，流速为1mL·min-1，进样口温度为250℃，不分流进样。
程序升温条件（40℃保持2min，再以5℃·min-1升温至130℃，保持1min；再以15℃·min-1升温至280℃，保持2min）
质谱条件：
离子源EI源，电子能量70eV，离子温度230℃，四级杆温度为150℃，倍增管电压1.2kV，扫描质量范围m/z35～550。
2.3方法
2.3.1体式荧光测定三种蒿属植物的腺毛体数
为了观察艾蒿、臭蒿、黄花蒿三种蒿属植物叶面腺毛体并加以比较分析，分别选取三种蒿属植物生长较旺盛的叶，轻轻去掉叶片上面的杂质进行压片制片，在AZ100型体式荧光DIC成像系统下分别观察叶上、中、下部位，并加以分析统计。
2.3.2三种蒿属植物挥发性物质测定
2.3.2.1器材预处理
在校内实习基地选取生长较旺盛的艾蒿和臭蒿植株带回实验室，同时选取生长程度相似的栽培在实习基地的黄花蒿植株。
将50mL试剂瓶洗涤干净并用蒸馏水润洗，然后将其放置在数显鼓风干燥箱中60℃烘干，实验开始前数分钟将其取出放置在室温条件下冷却备用。
2.3.2.2取样
分别选取艾蒿、臭蒿、黄花蒿三种蒿属植物生长较旺盛的叶，轻轻去掉叶片上面的杂质并放入分析天平中进行称重，并记录数据。
2.3.2.3萃取
将已称取的蒿属植物叶片加入到50mL试剂瓶中并称取适量的无水氯化钙加入其中，然后用8层封口膜对试剂瓶瓶口进行密封，并用2根橡皮筋将瓶口的封口扎紧，迅速插入已在进样口（250℃）老化30min的萃取杆，推出萃取头，在常温下萃取30min。
2.3.2.4测定
将已经萃取完毕的萃取头推回，将萃取杆迅速插入气相色谱-质谱联用仪的进样口，推出萃取头，解吸3min，进行测定。
然后重复上述步骤，依次其余的蒿属植物叶片挥发性物质。
3结果与分析
3.1三种蒿属植物叶片形态观测
为了辅助分析艾蒿、臭蒿、黄花蒿三种蒿属植物挥发性物质的差异，分别拍摄了艾蒿、臭蒿、黄花蒿三种蒿属植物叶片正反面的形态图和叶片正反面的显微图，如图1所示。
从艾蒿、臭蒿、黄花蒿三种蒿属植物叶片正反的形态图可以清楚的观察到叶片羽状深裂呈齿状。
艾蒿叶片较大，羽状深裂呈披针形，羽状叶片较宽较长，叶顶端呈针尖状[12]。
臭蒿叶片较小，羽状分裂，羽状叶片裂片长圆形较短较宽，有锯齿，小裂片呈线状披针形，叶顶端呈圆形。
黄花蒿叶片分叉较多，羽状深裂，裂片长椭圆状卵形且较细较长，再次分裂，小裂片边缘具有多枚长三角形或着三角形深裂齿，裂片矩圆形或着长椭圆形，两面被短毛，叶顶端呈针尖状；艾蒿叶片正面为深绿色，背面为白色。
臭蒿叶片正面为浅绿色，背面呈白色。
黄花蒿叶片正面为深绿色，背面为浅绿色。
图1三种蒿属植物叶片正反面的形态
Fig.1themorphologyoftheforward&reverseleavessurfacesofthreeplantsinArtemisia
从艾蒿、臭蒿、黄花蒿三种蒿属植物叶片正反面的显微图可以清楚的观察到，艾蒿叶片正面为深绿色，有白色腺点和少量白色短柔毛，叶片背面有大量而密度较小的密被灰白色蛛丝状密绒毛而呈白色，并有白色腺点[13]；臭蒿叶片正面为浅绿色，有白色腺点和许多柔毛，叶片背面有大量而密度较大的腺毛状短柔毛而呈白色，还有许多白色腺点；黄花蒿叶片为暗绿色，但叶片正面比其叶片反面颜色较深，叶片两面有短毛和椭圆形的气孔。
叶片正面和反面均布满腺毛和非腺毛，腺毛呈椭圆形，T形非腺毛位于叶脉附近。
叶面均有大量有白色腺点，但叶片反面有白色腺点较正面较多。
图2三种蒿属植物叶片正反显微图
Fig.2themicrographoftheforward&reversesurfacesofthreeplantsinArtemisia
3.2三种蒿属植物挥发性成分测定
将艾蒿、臭蒿、黄花蒿三种蒿属植物挥发性物质按照上述方法进行测定，对总离子流图中的各峰经过质谱扫描后得质谱图。
为了更好进行直观的比较，将三种蒿属植物挥发性成分总离子流质谱图进行叠加，经质谱数据库检索，并结合有关文献从基峰、相对丰度等几个方面进行直观比较，确定了三种蒿属植物挥发性成分的化学组成，其结果见图3。
图3三种蒿属植物挥发性物质总离子流叠加图
Fig.3TotalionflowsuperpositiongraphofthreeArtemisiavolatilesubstances
经固相微萃取法提取艾蒿、臭蒿和黄花蒿三种蒿属植物的挥发性物质，并用气相色谱-质谱联用法得总离子图对其化学成分进行鉴定，将各自的总离子流图谱进行分析，得出成分分析表，见表3.1。
从三种蒿属植物挥发性物质成分含量分析表中可知三种蒿属植物挥发性物质的主要成分均为萜类化合物，但单萜类化合物与倍半萜类化合物的含量很大，艾蒿挥发性物质中单萜类化合物（11.42%），倍半萜类化合物（83.83%），臭蒿挥发性物质中单萜类化合物（13.25%），倍半萜类化合物（63.42%），黄花蒿挥发性物质中单萜类化合物（35.93%），倍半萜类化合物（23.18%）。
三者均含有顺-3-己烯酸乙酯、蒈烯、桉树脑、大根香叶烯、β-石竹烯，但含量差别很大，艾蒿挥发性物质还含有罗勒烯、2，6-二甲基-1，5，7-辛三烯-3-羟基、樟脑、β-榄香烯、丁香烯、桉叶稀、杜松烯、E-环氧法尼稀，臭蒿挥发性物质还含有羟基脲、β-蒎稀、β-榄香烯、丁香烯，黄花蒿挥发性物质还含有3-己烯-1-醇、2-辛烯-4-醇、5，5-二甲基-1-乙基-1，3-环戊二烯、邻异丙基甲苯、莰烯、β-蒎稀、D-柠檬稀、π法尼烯。
艾蒿挥发性物质与臭蒿挥发性物质较多成分相同，但其含量不同。
黄花蒿挥发性物质与艾蒿和臭蒿挥发性物质成分差异较大，只有极少成分相同且含量不同。
表3.1三种蒿属植物挥发性物质成分含量分析
Table3.1AnalysisvolatilemattercontentofthreeArtemisia
三种蒿属植物挥发性物质
化学式
蒿属植物挥发性物质含量
备注
艾蒿
臭蒿
黄花蒿
羟基脲
CH4N2O2
0
18.31
0
其它
3-己烯-1-醇
C6H12O
0
0
2.85
醇类
顺-3-己烯酸乙酯
C8H14O2
4.56
3.54
20.44
酯
2-辛烯-4-醇
C8H16O
0
0
2.43
醇类
5,5-二甲基-1-乙基-1,3-环戊二烯
C9H14
0
0
4.73
烯烃
邻异丙基甲苯
C9H14
0
0
10.44
烯烃
莰烯
C10H16
0
0
3.19
单萜类化合物
罗勒烯
C10H16
1.53
0
0
单萜类化合物
β-蒎稀
C10H16
0
2.44
2.2
单萜类化合物
蒈烯
C10H16
3.27
2.19
2.94
单萜类化合物
D-柠檬稀
C10H16
0
0
1.07
单萜类化合物
2,6-二甲基-1,5,7-辛三烯-3-羟基
C10H16O
1.64
0
0
单萜类化合物
樟脑
C10H16O
3.01
0
25.39
单萜类化合物
桉树脑
C10H18O
1.97
8.62
1.14
单萜类化合物
大根香叶烯
C15H24
30.34
21.25
4.05
倍半萜类化合物
β-石竹烯
C15H24
29.69
25.86
9.41
倍半萜类化合物
β-榄香烯
C15H24
6.68
6.1
0
倍半萜类化合物
丁香烯
C15H24
5.32
10.21
0
倍半萜类化合物
桉叶稀
C15H24
3.58
0
0
倍半萜类化合物
杜松烯
C15H24
6.07
0
0
倍半萜类化合物
E-β-法尼烯
C15H24
0
0
9.72
倍半萜类化合物
E-环氧法尼稀
C15H24O
2.15
0
0
倍半萜类化合物
4讨论
经过对艾蒿、臭蒿、黄花蒿三种蒿属植物
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