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实验手册
生命科学学院
现代生物技术实验指导
二零一零年三月
实验一实验基本知识与操作
[实验目的与要求]
1.了解生物技术实验室中应该注意的事项
2.了解生物技术实验室常用仪器的操作及注意事项
[实验内容]
1.实验过程
实验前的准备-查资料，确定方法和试剂；购买或配制试剂；检查仪器；预试验等
实验中的操作-规范与方便相结合原则
实验后的处理-仪器清洗，材料灭菌等
2.寻找失败的原因
绝大多数应从实验操作入手，如试剂加错、反应时间不准、试剂配制出错、样品保存不当等，涉及到仪器损坏比较容易发现，涉及试剂（原始试剂）失效很少出现。
3.安全原则
生物技术试验涉及多种有毒试剂，如苯酚、DEPC、EB等，特别是戴的一次性手套不能到处乱动，造成污染。
4.离心机的使用
转速要从小到大，离心管严格平衡，用后将转速调至最小
5.移液器的使用
消毒-酒精棉球擦拭，紫外灯照射，勿高压；插枪头-旋紧，勿敲；用后一定调至最大刻度。
6.水浴锅的使用
使用蒸馏水，加水量要盖过加热器，到设定温度需要一定时间，需要事先调试。
7.高压锅的使用
使用蒸馏水，加水量要盖过加热器，对称旋紧螺母，防止漏气。
一般是121℃，有时115℃（含有葡萄糖）
通电加热，同时打开排气活门，排尽锅内的空气，即活门冲出的全部是蒸汽表示彻底，此时可关闭排气活门，若过早关闭活门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。
通常当压力表指针升至5磅时，打开排气活门放气，降至零点，再关闭活门。
压力表的指针上升时，国内温度也逐渐升高，当压力表指针升至15磅时，蒸汽温度相当于120-121℃（相当于一个大气压），此时开始计算灭菌时间，控制热源，使处于15磅压力保持20-30分钟，即能达到完全灭菌的目的，然后停止加温。
稍微打开一点排气活门，使锅内蒸气缓缓排除，逐渐开大活门，气压徐徐下降，注意勿使排气过快，否则会使锅内的培养基沸腾而冲脱或粘湿棉花塞，但排气过慢又使培养基在锅内受高温处理时间过长，这样对培养基也是不利的。
一般从排气到打开锅盖以10分钟左右为好。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
一般培养基用0.1MPa，121.3℃15-30分钟可达到彻底灭菌的目的。
灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
8.PCR仪的使用
关键是程序的设计，温度的准确性很重要。
9.核酸电泳仪的使用
涉及有毒物品，注意安全。
10.紫外分光光度计的使用
类似可见分光光度计。
[指导与训练方案]
1.掌握主要仪器使用方法和注意事项。
2.学会设定PCR程序。
实验二 质粒的提取
[实验目的与要求]
1、掌握碱裂解法提取质粒的实验原理。
2、了解提取质粒的实验步骤
[实验原理]
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
[实验材料与设备]
1、材料：
大肠杆菌（Escherichiacoli）菌株XL1-Blue，质粒pSAU1001。
2、仪器设备：
离心机、涡旋振荡器、恒温水浴锅，恒温摇床、高压灭菌锅试管，恒温培养箱、三角瓶、镊子，培养皿，剪刀，微量移液器、离心管、5mlEppendorf管、微量移液器枪头。
3、试剂：
溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、氯仿异戊醇（24：
1）、无水乙醇、70%乙醇、苯酚（Ph为8）、LB培养基、RNA酶（不含DNA酶）。
[实验步骤]
1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mlLB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜（约12-14hr）。
2、取1.5ml菌液，10000rpm离心1min，弃上清。
（若菌较少，可以再加菌液、离心）
3、100μl预冷碱裂解液Ⅰ，剧烈振荡。
4、200μl碱裂解液Ⅱ，快速颠倒离心管五次，勿振荡，放冰上
5、150μl碱裂解液Ⅲ，反复颠倒离心管数次，冰上5min
6、10000rpm离心5min，将上清移入一新的离心管中。
7、加等量的苯酚/氯仿/异戊醇（25：
24：
1）振荡混合，10000rpm离心3min，将上清移入一新的离心管中。
8、用两倍体积的乙醇沉淀核酸，可-20℃放置
9、10000rpm离心5min，收集沉淀
10、70%乙醇1ml洗涤一次，放置15min，挥发乙醇
11、用20-50μl灭菌水或TE（含RNaseA20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
[实验结果]
粗略：
出现沉淀
详细：
核酸电泳或紫外分光光度计
[指导与训练方案]
1、加入溶液II之后为什么要缓慢上下颠倒？
2、溶液III的主要作用是什么？
3、实验中使用苯酚、氯仿抽提，什么作用？
[注意事项]
1、加碱裂解液Ⅱ后，会出现拉丝现象，若没有拉丝可能失败。
2、加入乙醇后，离心出现沉淀，若没有表示失败。
3、本裂解法小量制备质粒DNA重复性好，一般无麻烦。
若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。
[试剂配制]
1．溶液Ⅰ:
。
1MTris-HCl（pH8.0）12.5ml＋0.5MEDTA（pH8.0）10ml＋葡萄糖4.730g＋ddH2O加至500ml，溶液浓度是50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0），在10lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。
1MTris-HCl（pH8.0）：
1MTris-HCl,pH8.0,500ml：
60.55gTris+400mlH2O+约26ml浓HCl
0.5MEDTA：
0.5MNa2EDTA，pH8.0,200mlEDTA难溶于水，应优先配制，并加入适量NaOH助溶：
37.22gEDTA+180mlH2O+约8gNaOH片（若是EDTA二钠盐可减半）
2.溶液Ⅱ：
0.2MNaOH，1%SDS。
2MNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
2MNaOH：
8gNaOH+96mlH2O
3.溶液Ⅲ：
5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。
4℃保存备用。
5MKAc:
245.35gKAc加500mlH2O
（乙酸；醋酸；冰醋酸【英文名称】aceticacid【结构或分子式】CH3COOH【相对分子量或原子量】60.05【密度】1.049醋酸钾（医药级）C2H3KO2F.W.98.14）
4.TE：
1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml，溶液浓度是10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0），10lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：
24：
1）
6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）
7.RNaseA（RNA酶A）：
不含DNA酶（DNase-free）RNaseA的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
8、LB的配制：
950ml去离子水中加入胰化蛋白胨（tryptone）10g，酵母提取物（yeastextract）5g和NaCl10g，完全溶解，用5mol/LNaOH（约0.2ml）调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，高压下蒸汽灭菌20分钟。
实验三 核酸提取质量的鉴定
[实验目的与要求]
掌握核酸电泳的原理和主要步骤。
[实验原理]
琼脂糖（或聚丙烯酰胺）凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法，操作简便快速。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（Ethidiumbromide,EB）染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
琼脂糖（或聚丙烯酰胺）可以制成各种形状、大小和孔隙度。
琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段，通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5-500bp）效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开，采用垂直装置进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。
目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。
[实验材料与设备]
1、材料：
质粒DNA
2、仪器设备：
水平式电泳装置，电泳仪，微量移液枪，微波炉或电炉，紫外透射仪，照相系统。
3、试剂：
溴化乙锭（EB），琼脂糖，电泳缓冲液，上样缓冲液。
[实验步骤]
1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。
2、胶液的制备：
称取0.5g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里（或电炉上）加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为1％琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
3、胶板的制备：
1）选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端。
2）制备1%琼脂糖凝胶，电炉或微波加热至琼脂糖融化均匀。
3）用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。
待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。
倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。
4）琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子，保持点样孔的完好。
5）将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。
如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。
4、加样：
取5μl样品与1μl6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。
若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。
每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳：
加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
6、观察和拍照：
在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板，最后照相。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
[实验结果]
[注意事项]
1、缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡。
2、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。
凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
3、琼脂糖凝胶的方向不要放反，否则样品会进入缓冲液中。
[试剂配制]
1、5×TBE：
Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。
15lbf/in2高压灭菌20min，4℃保存备用。
2、溴化乙锭（EB）：
10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。
3、6×loadingbuffer（上样缓冲液）：
0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
4、1%琼脂糖凝胶：
称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml，轻轻摇匀。
实验四质粒DNA的酶切
[实验目的与要求]
1、了解一般限制性内切酶的各种特性。
2、学习设计酶切方案的一般规律，对质粒pSAU1001进行单酶切
[实验原理]
限制性内切酶有特定的识别序列，并且在特异的识别位点上进行切割。
[实验材料与设备]
1、实验材料
质粒pSAU1001
2、仪器设备
离心机、移液器、恒温水浴锅,制冰机，温度计、0.5mlEppendorf管、微量移液器枪头
3、试剂
EcoRIV酶及其配套缓冲液
[实验步骤]
1.酶切反应
反应体系中依次加入如下试剂：
质粒DNA8ul
10×Buffer2ul
灭菌水9.5ul
EcoRI（10u/ul）0.5ul
酶切反应温度37℃保温1小时
2．终止反应：
65℃处理15分钟终止酶切反应。
-20℃冰箱保存。
备用。
[指导与训练方案]
1、在酶且体系中为什么要最后加入酶?
实验五PCR引物设计
[实验目的与要求]
1、掌握引物设计的基本原则。
2．了解常用的引物设计软件。
[实验原理]
一、引物设计有3条基本原则
引物与模板的序列要紧密互补
引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构
引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
二、引物设计要求
1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-24bp，但不应大于38。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高的序列（尤其是3’端），否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3、引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4.引物序列的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
6.引物二级结构对PCR反应的影响。
尽可能少的引物二聚体。
三、常用的引物设计软件
PrimerPremier5.0
Oligo6.0
[指导与训练方案]
1、引物设计的基本原则和要求？
2、了解PrimerPremier5.0、Oligo6.0的主要功能？
实验六聚合酶链式反应
[实验目的与要求]
1、了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响。
2．掌握PCR实验中各项基本技术。
[实验原理]
聚合酶链式反应是用耐热的TaqDNA聚合酶，在体外进行反复的变性、退火和引物延伸三个阶段，几十个循环后，使DNA呈几何级数扩增的一种方法。
PCR包含6种基本成分
1. 热稳定DNA聚合酶：
常规PCR，最常选用TaqDNA聚合酶。
2. 一对引物：
这是影响PCR反应的最关键因素。
3. dNTP：
在TaqDNA聚合酶反应液中包含1.5mmol/LMgCl2条件下，每种dNTP浓度一般在200～250μmol/L之间。
4. Mg2+：
用于激活热稳定DNA聚合酶。
5. 维持pH值的buffer：
标准PCR缓冲液中Tris－Cl浓度为10mmol/L。
6. 模板DNA：
高分子量DNA（>10kb）做模板时，用限制性内切酶先行消化。
PCR反应条件的控制：
1.上述组分的浓度
2.反应温度和循环次数
A变性温度和时间：
90～97℃，通常取95℃、30s
B退火温度和时间：
该温度决定着PCR反应的特异性。
合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。
引物和模板退火温度一般在45～55℃之间。
退火温度过低，非特异性扩增增多；退火温度过高，PCR扩增产量下降。
在Tm允许范围内，选择偏高的退火温度可提高PCR反应的特异性。
退火时间一般30s～1min之间足以使引物和模板完全结合。
C延伸温度和时间：
一般72℃左右，此时TaqDNA聚合酶具有较高的酶促活性。
延伸时间视扩增片断长度而定。
1kb以内的扩增片断，1min即可；3～4kb的靶序列3～4min。
D循环次数：
取决于最初靶分子的浓度，一般25～30次。
靶序列拷贝数低，可增加循环次数。
[实验材料与设备]
1、材料：
质粒pSAU1001
2、仪器设备：
PCR仪、0.5mlPCR薄壁管、琼脂糖凝胶电泳系统、微波炉、台式离心机、紫外透射仪、微量移液器
3、试剂：
引物：
P1（TCTAGATGGCGATGTCTTTCTCAGG）、P2（GAGCTCCCTACTTTGTGGCATCC）
双蒸水、微量移液器枪头、TBE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙锭（EB）、DNAmarker（DL2000）琼脂糖100g、TaqDNA聚合酶及其配套缓冲液，MgCl2溶液、dNTP
[实验步骤]
（1）配成如下浓度的反应体系
组分
终浓度
25u1/管
ddWater
10×PCRBuffer（-Mgcl2）
25mMMgcl2
10mMdNTPs（10mMeach）
5’Primer（l0pmol/u）
3’Primer（10pmol/μ1）
TaqDNApolymerase（4U/u1）
TotalVol/tube
1X
200mM
0.5U/25μ1
18.375μ1
2.5μ1
1.5μ1
0.5μ1
lμl
lμl
0.125μ1
25μ1
（2）反应条件：
编制PCR程序如下：
LID=105℃NOWAIT
1.T=95℃00:
04:
00
2.T=94℃00:
01:
00
3.T=59℃00:
00:
45
4.T=72℃00:
01:
00
5.GOTO2REP35
6.T=72℃00:
10:
00
7.HOLD4℃ENTER
END
设一空白对照和阴性对照。
通过1%的琼脂糖电泳检测PCR产物的大小。
[指导与训练方案]
影响PCR产物的因素有哪些？
[注意事项]
1、防治污染的发生和结果的假阳性
2、除实验样品外，应设置阳性对照、阴性对照和试剂对照
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