绿色荧光蛋白EGFP克隆并在大肠杆菌表达.docx

绿色荧光蛋白EGFP克隆并在大肠杆菌表达.docx

《绿色荧光蛋白EGFP克隆并在大肠杆菌表达.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《绿色荧光蛋白EGFP克隆并在大肠杆菌表达.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

绿色荧光蛋白EGFP克隆并在大肠杆菌表达

绿色荧光蛋白（EGFP）克隆并在大肠杆菌表达

详细项目实施计划书

生物技术1001班

1EGFP基因完整的序列:

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTA

2PCR引物

引物序列（5’-3’）酶切位点描述

PlGACGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGABamHI5’GFPgene

P2GCCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGEcoRI3’GFPgene

3

pEGFP-NB3B全图谱

实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。

此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。

本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。

在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamHI及EcoRI限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。

4

pET-28a质粒全图谱

表达EGFP蛋白使用的pET-28原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tagpolyHis编码序列；用于表达蛋白的T7启动子，T7转录起始物以及T7终止子；选择性筛选使用的lacI编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322启动子，以及为产生单链DNA产物的f1启动子。

5引物

一．材料

1实验材料

克隆菌E.coliDH-5a、表达菌BL-21，质粒pET-28a和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶BamH1、NotⅠ。

2仪器设备

电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套、pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、Parafilm膜、离心管。

3试剂及溶液

50×TAE电泳缓冲母液（50mL）

Tris-碱12.1g

冰醋酸2.85mL

0.5mol/LEDTA（pH8.0）5ml

-----------------------------------

6×DNA电泳缓冲液

溴酚蓝0.25%

蔗糖水溶液40%（W/V）

-----------------------------------

液体LB培养基（pH7.0）

胰蛋白胨10g/L

酵母提取物5g/L

NaCl10g/L

NaOH（1mol/L）1mL/L

分装后于121℃高压灭菌20min。

（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1%）；

溶液Ⅰ50mL

葡萄糖50mmol/L

Tris-Cl（pH8.0）25mmol/L

EDTA（pH8.0）10mmol/L

121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存；

溶液Ⅱ100mL

NaOH0.2mol/L

SDS1%（W/V）

用时由母液2mol/LNaOH、10%（W/V）SDS稀释现配；

溶液Ⅲ100mL

KOAc（5mol/L）60mL

冰乙酸11.5mL

H2O28.5mL

121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存；

氯仿；

琼脂糖；

灭菌的去离子水；

10×酶切缓冲液；

TaqDNA聚合酶；

TaqDNA聚合酶缓冲液；

灭菌的0.1mol/LCaCl2

标准相对分子质量的DNA；

溴乙锭（EB）储存液0.5µg/mL；

LB/Kan（50µg/mL）固体培养基；

IPTG配成浓度为400mM水溶液，-20℃保存备用；

卡那霉素（Kan）配成浓度为100ug/mL水溶液，-20℃保存备用；

70%乙醇：

用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4℃；

无水乙醇（分析纯，武汉市中天化工有限公司）放在0~4℃；

RNase母液：

将RNase溶于10mmol/LTris•Cl（pH7.5）、15mmol/LNaCl配成的试剂中，配成10mg/mL的溶液，在100℃加热15min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃；

二．方法

1重组质粒的构建

图1重组质粒pET-28a-GFP的构建流程

2DH-5α和BL-21感受态细胞的制备

1）将0~4℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37℃下250r/min过夜培养16h。

2）将分别接种过夜菌：

LB按1:

50的比例接种于2mL的LB液体培养基中，37℃活化培养2～3h至OD=0.3～0.5。

3）取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10min,然后于4℃下5000r/min离心5min。

弃上清液，沉淀加入0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2缓和悬菌。

冰上放置15-30min后，4℃下5000r/min离心10min。

4）弃上清液，沉淀用0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20℃冰箱内保存。

3感受态细胞的转化

1）取制备好的感受态细胞100μl，冰上解冻，均匀悬浮。

2）加入2μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30min。

3）42℃水浴中热击70sec后，冰上放置2min。

4）加入200μlLB液体培养基，37℃，50-100rpm振荡培养1h。

5）取200l悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h。

4碱法提质粒

1）感受态细胞经转化培养后，平皿内有但菌落长出。

2）用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2mL含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,180r/min振荡培养过夜。

3）取1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃、11000r/min离心1分钟，吸弃上清。

4）向离心管中加入150l用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀。

5）加入200l新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。

6）加入150l用冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置3~5分钟。

7）用微量离心机于4℃、11000r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。

8）加等体积氯仿400l抽提，振荡混匀，用微量离心机于4℃、11000rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。

9）吸取上清液300l，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4℃、11000rpm离心5分钟，弃上清。

10）用70%乙醇洗涤2次，再次4℃、11000rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。

向已干燥的离心管内加20l超纯水溶解质粒DNA，加入2l10mg/mlRNA酶，37℃处理1小时后于-20℃贮存。

5酶切鉴定

1）取提取的质粒8l于另一微量离心管中，加入2lBamHI和EcoRI的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。

2）离心，使溶液聚集在管底部。

3）37℃，酶切反应。

6琼脂糖凝胶电泳

1）称取0.8g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100mL1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至6℃左右。

2）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。

3）将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。

4）吸取10l的质粒与2l的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。

5）接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100V,I=30mA。

6）当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

7）在凝胶成像分析系统中观察结果。

7PCR-聚合酶链式反应

1）将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分

PCR反应体系

各成分的量

template

0.1l

P1（20mM）

0.2l

P2（20mM）

0.2l

dNTPs（10mM）

0.4l

Taqs（5U/l）

0.2l

10×PCRbuffer

2l

ddH2O

16.9l

Total

20l

2）将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。

预变性95℃3min，变性95℃30s，退火60-55℃30s，延伸72℃1min10个循环，每个循环降0.5℃。

变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min20个循环，72℃延伸2min。

3）PCR扩增完毕后，取出PCP管放在冰盒上。

4）取8l扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。

8pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21

1）取100μl感受态BL-21，冰上慢速解冻，均匀悬浮。

加入2μl经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP，轻轻混匀，冰上静置10-30min。

2）42℃水浴热激70s，冰上放置2min。

3）加入200μl含抗生素的LB液体培养基，37℃，60r/min震荡培养30min。

四支EP管中加入0.5μl的100mM的IPTG诱导，另外EP管中不加入IPTG诱导。

4）吸取200μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h。

9重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达

1）取GFP重组菌接种于2mlLB培养液（含Kana100mg/l）中，37℃150-220r/min过夜培养。

2）将20μl菌液按1：

50—100接种于2mlLB培养液（含Kana100mg/l）中，37℃200r/min培养2h。

3）按IPTG:

LB培养基按1:

1000加入2μl的IPTG诱导表达，继续培养，对照组不加IPTG诱导。

4）用紫外线照射菌体沉淀，保存照片。