绿色荧光蛋白EGFP克隆并在大肠杆菌表达.docx

1、绿色荧光蛋白EGFP克隆并在大肠杆菌表达绿色荧光蛋白（EGFP）克隆并在大肠杆菌表达详细项目实施计划书生物技术1001班1 EGFP基因完整的序列:ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACC

2、CCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCA

3、GCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTA2 PCR引物引物 序列（5-3） 酶切位点 描述Pl GAC GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA BamH I 5GFP gene P2 GCC GAATTC TTACTTGTACAGCTCG

4、TCCATG EcoR I 3GFP gene3 pEGFP-NB3B全图谱实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及EcoR I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。4 pET-28a质粒全图

5、谱表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。5 引物一材料1 实验材料克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21，质粒pET-28a和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、Not 。2 仪器设备电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套、pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电

6、泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、移液枪、枪头 、接种环 、酒精棉球 、灭菌枪头 、Parafilm膜、离心管。3 试剂及溶液 50TAE电泳缓冲母液（50 mL） Tris-碱 12.1 g冰醋酸 2.85 mL0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 5 ml-6DNA电泳缓冲液 溴酚蓝 0.25 %蔗糖水溶液 40%（W/V）-液体LB培养基（pH7.0） 胰蛋白胨 10 g/L酵母提取物 5 g/LNaCl 10 g/L NaOH(1 mol/L) 1 mL/L 分装后于121 高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；溶液 50 mL

7、葡萄糖 50 mmol/LTris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L121高压灭菌 15 min后置于04贮存；溶液 100 mL NaOH 0.2 mol/LSDS 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；溶液 100 mL KOAc (5 mol/L) 60 mL冰乙酸 11.5 mLH2O 28.5 mL 121 高压灭菌 15 min后置于04 贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲液；灭菌的0.1 mol/L CaCl2标准相

8、对分子质量的DNA；溴乙锭（EB）储存液 0.5 g/mL；LB/Kan（50 g/mL）固体培养基；IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在04 ；无水乙醇（分析纯，武汉市中天化工有限公司）放在04 ；RNase 母液：将RNase 溶于10 mmol/L TrisCl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl 配成的试剂中，配成10 mg/mL的溶液，在100 加热15 min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于20 ；

9、二方法1 重组质粒的构建图1重组质粒pET-28a-GFP的构建流程2 DH-5和BL-21感受态细胞的制备1) 将04 保存的DH-5和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37下250r/min过夜培养16h 。2) 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37活化培养23h至OD=0.30.5。3) 取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10min,然后于4下5000 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30min后，4 下5000r/min离心10min。4) 弃上清液，沉淀

10、用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在20冰箱内保存。3 感受态细胞的转化1) 取制备好的感受态细胞100 l，冰上解冻，均匀悬浮。2) 加入2 l酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30min。3) 42水浴中热击70sec后，冰上放置2min。4) 加入200lLB液体培养基，37 ，50-100rpm振荡培养1h。5) 取200l悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，封口膜封好平皿，37 培养倒置12-16h。4 碱法提质粒1) 感受态细胞经转化培养后，平皿内有但菌落长出。2) 用灭菌吸头挑取单菌落

11、，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37, 180r/min振荡培养过夜。3) 取1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4、11000r/min离心1分钟，吸弃上清。4) 向离心管中加入150l用冰预冷的溶液，用微量移液器吹打重悬沉淀。5) 加入200 l新配制的溶液 ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。6) 加入150 l用冰预冷的溶液 ，轻轻混匀，冰上放置35分钟。7) 用微量离心机于4 、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。8) 加等体积氯仿400 l抽提，振荡混匀，用微量离心机于4、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离

12、心管中。9) 吸取上清液300l，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4、11000rpm离心5分钟，弃上清。10) 用70%乙醇洗涤2次，再次4、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加20l超纯水溶解质粒DNA，加入2l 10mg/ml RNA酶，37 处理1小时后于-20 贮存。5 酶切鉴定1) 取提取的质粒8l于另一微量离心管中，加入2l BamH I和EcoR I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。2) 离心，使溶液聚集在管底部。3) 37，酶切反应。6 琼脂糖凝胶电泳1) 称取0.8 g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100

13、 mL 1TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至6 左右。2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。4) 吸取10l的质粒与2l的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。5) 接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100 V,I=30 mA。6) 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。7) 在凝胶成像分析系统中观察结果。7 PCR-聚合酶链式反应1) 将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分PCR反应体系各成分的量templ

14、ate0.1 lP1(20 mM)0.2 lP2(20 mM)0.2 ldNTPs(10 mM)0.4 lTaqs(5 U/l)0.2 l10PCR buffer2 lddH2O16.9 lTotal20 l2) 将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性95 3 min，变性95 30 s，退火60-55 30 s，延伸72 1 min 10个循环，每个循环降0.5 。变性95 30 s，退火55 30 s，延伸72 1 min 20个循环，72 延伸 2 min。3) PCR扩增完毕后，取出PCP管放在冰盒上。4) 取8 l扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。8 pET-28a-

15、GFP重组质粒转化到表达菌BL-211) 取100 l感受态BL-21，冰上慢速解冻，均匀悬浮。加入2 l经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。2) 42水浴热激70 s，冰上放置2 min。3) 加入200 l 含抗生素的LB液体培养基，37 ，60 r/min震荡培养30 min。四支EP管中加入0.5 l 的100 mM的IPTG诱导，另外EP管中不加入IPTG诱导。4) 吸取200 l菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 培养倒置12-16 h。9 重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达1) 取GFP重组菌接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 150-220 r/min过夜培养。2) 将20 l菌液按1：50100接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 200r/min培养2h。3） 按IPTG: LB培养基按1:1000加入2 l的IPTG诱导表达，继续培养，对照组不加IPTG诱导。4） 用紫外线照射菌体沉淀，保存照片。