中药微生态制剂对后备母猪免疫应答及抗猪圆环病毒和蓝耳病毒影响的初步观察.docx
《中药微生态制剂对后备母猪免疫应答及抗猪圆环病毒和蓝耳病毒影响的初步观察.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中药微生态制剂对后备母猪免疫应答及抗猪圆环病毒和蓝耳病毒影响的初步观察.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
中药微生态制剂对后备母猪免疫应答及抗猪圆环病毒和蓝耳病毒影响的初步观察
中药微生态制剂对后备母猪免疫应答及抗猪圆环病毒和蓝耳病毒影响的初步观察
摘要目的：
为探索控制动物病毒感染的新方法，观察中药微生态制剂“毒疫肽”对猪免疫应答和抗蓝耳病毒（PRRSV）及猪圆环病毒（PCV-2）感染的影响，本实验在猪场后备母猪的饲料中添加0.2%“毒疫肽”，采用荧光定量PCR检测血液中的带毒情况，比较处理组饲喂添加“毒疫肽””前后以及与对照组血液中PRRSV及PCV-2带毒率的变化；比较“毒疫肽”饲喂前后母猪体内免疫细胞CD4、IL-10基因表达水平的变化。
方法：
采用荧光定量PCR检测血液中病毒相对数量和免疫细胞的CD4、IL-10基因mRNA水平的变化情况，比较“毒疫肽”饲喂对动物免疫机能的影响特性。
结果：
后备母猪饲喂“毒疫肽”后，PRRSV、PCV-2感染率明显减少，PRRSV实验组收到明显的保护效果，对照组在相同环境下感染数量上升到2/5；PCV2实验组由4/5下降到1/5，而对照组反而由1/5上升大5/5。
病毒含量也显著降低，以β-Actin为内参，实验组PRRSV受到保护无上升，对照组含量由0.08上升到100；实验组PCV2含量由18下降到0.7，对照组由0.88上升到48。
；实验组血液免疫细胞的CD4表达水平显著升高，而实验组的IL-10水平较对照组显著降低。
这显示“毒疫肽”加入饲料可显著增强动物的免疫水平，IL-10的下降有助于改善免疫细胞控制和清除体内的病毒，提高其抗PRRSV、PCV-2感染的能力，为实际生产中防治圆环病毒病和蓝耳病提供了新思路。
关键词：
中药微生态制剂、中药、微生态、活菌、益生素、“毒疫肽”、PRRSV、PCV-2、后备母猪、CD4、IL-10、基因表达、荧光定量PCR
前言
近年广泛流行的免疫抑制病，如猪呼吸与繁殖综合征（PRRS）和猪圆环病毒（PCV-2）引起的仔猪断奶后多系统衰竭综合征（Post-weaningmultisystemiewastingsyndrome，PMWS）等病，对我国养猪业造成了极严重损害，猪群生产性能下降，母猪流产增多。
特别是产房及保育仔猪大量发病及死亡，损失极为惨重。
2008年及2010年下半年猪肉价格攀升，国内CPI指数不断提升，目前已被公认与猪只疫病暴发，死亡过多，供应失调密切相关。
健康猪群中的高带毒率不仅影响猪的生长发育和增重，也是疫病暴发的基础。
目前动物疫病肆虐，饲养和疾病防治中抗生素滥用涉及食品安全的问题更为人们深切关注。
在动物感染PRRSV和PCV2的过程中，IL-10基因和CD4基因表现出显著的改变，两种病毒对动物的免疫应答调控和关键的Th细胞分化和生长均有抑制。
Sipos等对PMWS感染猪的细胞因子mRNA及蛋白质水平进行研究发现，其外周淋巴细胞中IL-10表达水平很高，表明IL-10的过量表达可能引起免疫反应向对机体不利的方向发展。
J．Nielsen等用PCV2攻毒3周龄仔猪，14～21天后出现PMWS临床症状的仔猪有明显的淋巴细胞减少征，而未出现症状的感染猪及阴性对照猪淋巴细胞无明显变化，动力学分析发现其CD3+淋巴细胞均有明显的减少；PCV2攻毒猪的T淋巴细胞亚群也有变化，CD3/C4/CD8三联标签检测，CD3+CD4+cD8+记忆/激活细胞的含量明显下降。
因此，降低IL-10基因表达水平或维持IL-10基因在低水平表达对动物抗病毒免疫应答和机体健康有重要意义。
CD4基因表达水平与阳性Th免疫细胞数量的比例成正相关，对促进机体抗病毒免疫功能，提高抗病抵抗力具有推动作用。
在动物免疫应答过程中，作为非特异免疫调控的重要组成和有直接杀菌、抗病毒效果的活菌中药发酵制剂在近年来发挥出突出的效果和贡献。
中药微生态制剂是指选取优质中药利用活性乳酸菌进行发酵来达到提高功效的作用。
中药活菌发酵的五大革命：
1、中药成分经过益生菌转化，由大分子变成小分子，100%被机体吸收。
2、真正的疗效提速，30分钟吸收到达血液。
3、真正的药效提高，发酵中药比传统中药提高4-28倍。
4、发酵过程分解毒性，真正无毒副作用。
“是药三分毒”成为历史。
5、改善中药口味，使“良药不再苦口”
在猪场饲料中添加“毒疫肽”展现了优异的效果，如母猪产仔率提高、死胎率下降,特别对保育期仔猪具有明显增重效应,临床对僵弱仔猪的生长改观；促使我们对本动物进行实验，观察其对猪体内PCV-2和PRRSV带毒率的影响。
通过实验，我们找到了一种新型、经济、高效的预防和治疗猪感染PCV2和PRRSV的新途径。
1．实验材料
1.1“毒疫肽”
中药微生态制剂，由合肥太阳雨生物工程有限公司提供的商品化制剂，商品名为“毒疫肽”。
1.2实验猪
后备母猪对比实验：
180日龄加系后备母猪10头，体重90-100公斤，由江苏省徐州市某原种猪场提供和饲养管理,分为实验组5头和对照组5头，实验组饲料中添加0.2%“毒疫肽”，除此之外两组所用基础饲料一致，饲养管理条件相同。
实验母猪开始前和开始饲喂添加“毒疫肽”饲料后10、20天，各自采抗凝血5ml，分析血中PCV-2，PRRSV的变化。
1.3实验试剂
RNA提取：
TIANGENTRNzol总RNA提取试剂盒，RNApreppure血液总RNA提取试剂盒（天跟生化科技有限公司，北京），氯仿（分析纯），异丙醇（分析纯）;反转录：
TIANGENQuantcDNA第一链合成试剂盒（天跟生化科技有限公司，北京）；荧光定量PCR:
TIANGENQuantqRT-PCR（SYBRGreen）Kit，RealMasterMix（SYBRGreen）（天跟生化科技有限公司，北京）；引物合成：
上海英俊生物技术公司。
2．实验方法
2.1实验时间和饲养管理
实验时间：
2011年10月21日至2011年11月13日期间，具体采血时间为饲喂开始点前采血、饲喂后10天以及饲喂后20天采血。
实验组后备母猪的饲养管理、饲养环境、免疫程序与对照组完全相同。
均采用标准化猪场管理流程。
2.2实时定量RT-PCR检测母猪的体内PCV-2、PRRSV，IL10基因、CD4基因的变化
通过对PCV2病毒DNA和PRRSV病毒RNA的提取、反转录采用天根公司反转录试剂盒。
定量检测用相对定量方法，试剂盒采用天根公司Q-PCR试剂盒。
对血浆中全细胞的mRNA的提取来检测IL10基因、CD4基因的变化。
（引物设计参考PRIMER5.0,Blast：
NCBI）
表1病毒检测引物：
PRRSVPCR产物长度为217bp,PCVPCR产物长度为145bp
引物名称
碱基序列
PRRSV-F：
TTGTGGTGTATCGTGCCG
PRRSV-R：
CAAGGAAATGGCTGGTGG
PCV-F：
ATAACCCAGCCCTTCTCCTACC
PCV-R：
GGCCTACGTGGTCTACATTTCC
表2内参基因β-Actin，IL-10、CD4基因引物的设计：
PCR产物248bp
Genes
SequencesofPrimers
β-ActinF：
5'-CTCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'
β-ActinR：
5'-CCTTCTGCATCCTGTCGGCAA-3'
CD4+-F
5’ACACAGCCTCAGTTACCGAGTTG3’
CD4+-R
5’CCTCTTGTCTTCCACTTCGCAGAT3’
IL-10-F
5’GCAGCCAGCATTAAGTCTGAGAAC3’
IL-10-R
5’GTCAGCAACAAGTCGCCCATCT3’
分离猪外周血免疫细胞，用Trizol法提取全基因组RNA；采用天根（TianGen）公司cDNA第一链合成试剂盒，20ul体系。
37℃1小时对全RNA进行反转录；实时定量PCR检测PCV-2、PRRSV、IL-10、CD4基因，条件如下：
体系为25ulSYBRGreen反应体系，具体如下：
2.0ulcDNA、1.0ul上游引物、1.0ul下游引物、12.5ulSYBRGreenPCRMasterMixed反应液，加超纯水至25ul。
经过优化，最后确定实施实验的反应条件为：
95℃，10s；95℃、5s，56℃、20s，72℃、15s，40个循环，退火温度56℃。
2.3数据分析方法：
PCV-2的含量以β-Actin为内参基因，最终以相对表达量来表示，相对荧光定量计算方法采用2-△△CT法计算而来。
所有数据均采用Excel进行整理，采用SPPSN.5统计软件进行统计处理，结果用平均数士标准差表示，实验组间差异用t检验进行分析。
3结果
3.1实验后备母猪体内PCV-2含量的变化
表3后备母猪PCV-2含量的变化结果
日期
处理前
处理后10天
处理后20天
对照组
0.08±0.08b
9.98±0.76a
43.88±24.08a
实验组
18.53±15.29a
0.08±0.07b
0.74±0.40b
*：
有不相同字母的数据差异显著（P<0.05）；反之，亦然（P>0.05）。
图1后备母猪体内PCV-2的含量变化
表4后备母猪PCV-2阳性的检测结果
采血时间（天）
组别
母猪编号
处理前
处理后10天
处理后20天
对照组
1
-
++
++
2
+
+
++
3
-
+
++
4
-
-
++
5
-
-
++
阳性率
1/5
3/5
5/5
实验组
6
-
-
-
7
+
-
-
8
++
+
-
9
+
-
-
10
++
-
+
阳性率
4/5
1/5
1/5
从上表3、表4，图1可知：
饲喂“毒疫肽”的后备实验母猪体内的PCV-2不仅阳性率从4/5显著下降到1/5，含量也明显减少；与此相反，对照组母猪的PCV-2阳性率从1/5显著上升到5/5，且含量也明显高于实验母猪。
3.2实验后备母猪体内PRRSV含量的变化
表5后备母猪PRRSV含量的变化
采血时间
处理前
处理后10天
处理后20天
对照组
0.01±0.05a
1.21±0.54a
100.88±43.76b
实验组
0.03±0.01a
0.11±0.04b
1.4401±0.01b
*：
有不相同字母的数据差异显著（P<0.05）；反之，亦然（P>0.05）。
从上表5、表6、图2可知：
实验组母猪体内的PRRSV不仅阳性率（1/5）低于对照组母猪（2/5），而且含量也明显少于对照母猪；表明：
与同样饲喂条件的对照猪相比较，“毒疫肽”饲喂母猪对PRRSV感染可能有较强的抵抗力。
3.3免疫细胞IL-10基因表达的变化
表7实验猪血液免疫细胞IL-10基因表达值的变化
采血日期
对照组
实验组
处理前
1.523±0.14A
1.934±0.31A
处理后10天
5.48±0.58A
1.73±0.28B
处理后20天
10.42±1.20A
0.80±0.34B
从上表7和图3中可见：
与对照母猪比较，“毒疫肽”饲喂母猪的血液免疫细胞中IL-10表达量显著减少，说明其体内IL-10的抑制性免疫调节作用明显减弱；
3.4实验猪免疫细胞的CD4基因表达变化
表8后备母猪血液免疫细胞CD4基因表达量变化
采血日期
对照组
实验组
处理前
0.10±0.01A
1.13±0.11A
处理后10天
2.85±0.44B
81.42±4.42A
处理后20天
0.31±0.12B
57.74±4.77A
从表8和图4中可见：
与对照母猪比较，实验组“毒疫肽”饲喂母猪的血液免疫细胞中CD4表达量显著增加（P<0.01），说明其体内CD4的免疫调节作用显著增强，有利于动物提高其免疫防御水平，加强对病毒和细菌等病原感染的清除能力。
4、讨论和结论
上世纪末国内发现PCV-2抗体阳性猪，随后抗原阳性猪被不同学者陆续证实；通过流行病学调查、临床病症观察、剖解及PCR检测证实国内已有单纯PCV-2引致的种猪与保育猪临床症状及死亡病例[4，7]。
甚至在外表健康屠宰猪及新生仔猪体内扩增出PCV-2片段，显示国内猪只PCV-2感染的广泛性。
国内猪群PCV-2高带毒率的不断报道，显示PCV-2同样是国内猪场重要的免疫抑制疫病。
一般通常认为PCV-2可单独与PRRSV或其他病原协同作用致使猪免疫功能抑制或减退，诱导继发感染，出现临床病症。
实验结果显示：
“毒疫肽”拌料口服可以有效减少实验猪血液病毒的阳性率与数量，特别对PCV-2更为明显。
实验开始时，血清内PCV-2带毒率高达4/5，最后在24天实验结束时，PCV-2带毒率仅为1/5，不仅带毒率下降，而且血清内病毒数量也有明显减少，显示“毒疫肽”对PCV-2不仅有抑制，而且还有清除作用。
相反，对照组PCV-2带毒率由实验初的1/5阳性、中期3/5阳性、最后实验结束时增加为5/5阳性，与实验组有显著差异。
以前通过体外实验发现，“毒疫肽”加入培养的Marc-145细胞中可产生良好的抗PRRSV病毒增殖的效应；现在本实验发现“毒疫肽”饲喂后备母猪的PRRSV感染率和病毒含量明显低于对照母猪（P<0.05）。
这可能与其添加的“毒疫肽”结合病毒，减少或阻止病毒侵入细胞的数量，并干扰与延缓病毒复制有关。
实验组免疫细胞IL-10基因的表达值在整个实验期内被调控维持在较低水平，24天实验结束时，平均值仅为实验初的1/3，而对照猪血清IL-10含量几乎为实验初的近7倍。
显示“毒疫肽”对机体免疫抑制因子的分泌具有良好的抑制减少作用，对维持和促进机体正常免疫功能有良好的效应。
而对照组IL-10血清内含量明显偏多，影响并减弱机体的免疫功能。
实验开始前实验猪血液内免疫细胞的CD4表达水平两组差异不显著（P>0.01）;实验开始后实验组的CD4表达水平明显增加，高于对照组近50倍，差异极为显著（P<0.01）。
CD4分子表达水平显著增加，表明CD4阳性Th免疫细胞数量上升，功能增强；这对促进机体抗病毒免疫功能，提高抗病抵抗力具有推动作用。
本实验的初步结论如下：
1）.后备母猪口服“毒疫肽”可减少体内PCV-2、PRRSV的带毒率。
2）.口服“毒疫肽”后，实验组IL-10基因mRNA的降低和CD4基因mRNA升高反映出动物的免疫调控受免疫抑制性病毒的影响降低；动物本身的抗病毒感染和清除能力得到提升。
3）.实验结果提示“毒疫肽”是具有良好开发应用前景的新型生物制剂，为实际防治圆环病毒和蓝耳病提供了新思路。
（责任编辑：
合肥太阳雨生物工程有限责任公司技术部）
升级会员 