核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素.docx

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核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素

核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素

中国人民解放军第302医院王海滨

一、临床分子生物学检验面临的问题与挑战

（一）国家药监局审评中心新行规：

核酸提取是关键！

1.HBVDNA敏感性报告<30IU/ML，防止实验室污染问题！

2.标本加样量不少于200微升；干扰与敏感性的矛盾！

3.核酸加样量不少于20微升、反应体积不少于40微升！

4.磁珠法应用的挑战！

血站核酸筛查？

5.定量内标漂移对结果的影响

6.试剂盒考核：

增加抗污染和敏感性能评价指标！

（二）不同核酸提取方法对检测质量的影响

影响核酸提取的因素有很多，以磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料进行比较。

标本：

200微升血清

方法：

磁珠法：

市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇；

层析柱法：

市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇；

碱性裂解法：

PEG介导；

生物合成材料：

无胍、无醇。

PCR扩增：

取等体积提取核酸或磁珠悬液（10微升），同一PCR扩增液。

我们采用四种方法材料进行同一样本核酸提取，然后采用统一试剂对相同提取核酸进行PCR扩增，结果差别非常大，磁珠法和层析柱法基本差不多，层析柱法稍微滞后于磁珠法，碱性裂解法最差，而且100IU无结果。

复合材料的敏感性，是磁珠法或层析柱法的30倍左右。

过去，我们对荧光PCR试剂或分子生物学试剂，往往关注扩增部分，而把提取部分忽视了，现在来看，提取部分也非常重要。

二、临床实验室核酸制备方法分类

（一）临床实验室核酸制备基本方法

基本的方法有四种：

1.煮沸法

最常用的是PEG聚乙二醇6000，血清和提取液混匀，之后使病毒沉淀，离心，然后对沉淀物进行高热电解试验。

有文章提出，弃掉的上清含有的病毒更多。

2.一管法

血清加到微量的裂解液里面混匀，试液配好以后，加进去就可以了。

目前市场上有几家公司都用该检测方法。

从临床检验的角度来说，一管法略微简略。

但是敏感性，已经达到了100IU，而且其稳定性非常好。

不用煮沸，或者经过简单的煮沸。

虽然目前药监局审评中心，不提倡用一管法，但是一管法的稳定性，抗污染性，简易程度，实际上优于磁珠的方法。

因为磁珠非常小，而且在乙醇下，非常容易挥发，易导致实验室的污染，

3.层析柱法

层析柱法优于磁珠法，没有发生漂浮的情况，虽然也可以导致污染，但污染源限于液体，即使用试剂中的污染物。

比如普通的筛查，建议大家用一管法来做，毕竟经济、简便、快速等，敏感性达到100IU，也能满足临床的需要。

（二）磁珠或层析柱胍盐提取核酸多步骤的弊端

乙醇在核酸提取中的利与弊的关系，由于乙醇容易蒸发，在磁珠里面的乙醇容易挥发造成污染。

大家不妨做一个试验，在乙醇里面加上磁珠，放在玻片上，在显微镜下看一看，可以看到在乙醇里面的磁珠就像巨峰一样，波涛汹涌。

在玻片边缘的磁珠，随着乙醇蒸发而迸溅。

所以，很容易发生交叉污染，而且非常严重。

磁珠和层析柱方法关联的次序，有病毒裂解，然后核酸吸附，还有漂洗，最后是洗脱。

目前诊断试剂HBVDNA，HCVRNA，HIVRNA等，第一个过程是病毒裂解以后，把磁珠收集了，然后漂洗、洗脱。

（三）层析柱法核酸丢失

1.过滤核酸丢失

PPT6显示的是过滤液再过柱5次取得核酸，第一次过滤的液体，为1虑，再过滤一次，为2虑，然后反复一直到5虑。

图中是高含量、中含量与低含量，低含量是100IU左右，也就是说，滤下来的东西再过滤，还有核酸被收集到的，这就是核酸的丢失。

PPT7显示的滤过液再进行核酸提取5次数据，通过计算发现，丢失率为60%以上。

PPT8显示的是5次过滤丢失的曲线图，过滤液中存在核酸的丢失，不同浓度标本的核酸的丢失差异较大。

2.洗脱核酸丢失

PPT9显示的是层析柱反复洗脱核酸的丢失，进行了七次洗涤。

结果发现第一次洗脱核酸量较高，2洗到7洗，核酸含量基本上差不多，这也是丢失的环节。

PPT10显示的是层析柱反复洗脱核酸数据。

PPT11显示的是7次洗脱核酸丢失率的图，不同浓度标本中层析柱上的残留核酸，差异也较大。

PPT12显示的是高浓度标本反复洗脱得到的PCR曲线和Ct值，进行了17次洗脱，可以看到，从第九次或者第八次以后，基本上在18、19左右徘徊，即最后会达到一个平台，说明层析柱粘附的核酸量非常多。

PPT13显示的是洗脱液加热对照得到的Ct值，可以看到，加热洗脱，核酸洗脱下来的量明显升高。

（四）PEG提取法核酸丢失情况

PPT14显示的是PEG提取法核酸的丢失，PEG和血清或血浆混匀以后，沉淀的上层还含有大量的病毒。

PEG存在很多的问题，沉淀很难再混匀，故每次检测结果可能明显的不同，这也是PEG的方法最后被取消的原因之一。

（五）血清标本干扰物质对荧光PCR检测的影响

PPT15显示了干扰物质的罗列，分为溶血组、脂血组、黄疸组，及对照组。

可以看到，这三种方法是可比的。

干扰最大的是黄疸组，但是这几个方法的比较呢，实际上没有质的差异。

PPT16显示的是两个一管法的比较，可以看到，一管法1有一个特点：

干扰物质的影响不大。

但是一管法2干扰物引起波动。

由于一管法1中的蛋白做了消融，一管法2在室温混匀以后，直接加反应液，故有差异。

因此在临床上，更为主张采用一管法1，也就是做温处理，使里面的干扰物质清除。

（六）不同核酸吸附材料（磁珠）

PPT17显示的是不同核酸吸附材料的影响，实验中用了两种不同的裂解液与两种不同的磁珠：

1.磁珠1

不同裂解液比较发现，高中低拷贝的标本都一样。

2.磁珠2

不同裂解液比较发现，高中低拷贝的标本明显不同。

说明磁珠的材料对检测结果的影响很大。

（七）同一试剂，不同核酸提取方法

不同的提取方法，核酸的丢失也不一样。

提取样本量与核酸得率的关系，是1＋1≠2现象，即加入的血清量，并不是越多越好，比如加100微升或50微升的血清，并不是加100微升血清核酸提取得率，一定是加50微升血清的一倍。

实际上有时血清加的越多可能干扰物质越多，这要通过不同的实验进行验证。

对100μl高中低含量HBVDNA血清采用COBASTaqMan、罗氏Meg2.0核酸提取仪和本实验室建立的磁珠法进行核酸提取，同时采用同一试剂进行定量。

试验发现有的核酸提取方法，核酸丢失率非常大。

三、核酸提取的交叉污染

（一）仪器核酸提取的交叉污染

PPT19显示的是核酸提取仪，这种仪器有很多种，国产的、台湾的、进口的。

它们几乎都有一个共同的特点：

交叉污染。

虽然好多厂家都做了相应的调整，但到目前为止，没有完全不污染的。

PPT20显示的仪器是MegNAPure2.0（Roche）。

PPT21是全自动的核酸提取和扩增系统。

PPT22显示的是核酸提取仪核酸污染情况，这是最早的数据，交叉污染的实验设计：

某核酸提取仪109与阴性对照间隔进行核酸提取并检测。

连续做了八个阳性和八个阴性对照，发现有四个对照发生了交叉污染，污染率很高。

（二）实验室污染的监控

实验室污染的监控，是荧光实验室或分子生物学实验室的重中之重，分为试剂污染、环境污染、核酸提取污染，而且污染曲线有一定的特征。

（三）几种防污染措施的效果评价

污染是目前临床分子生物学实验室比较头疼的问题，也是实验室真正的水平的体现。

防污染的措施有很多，最有效的是实验室的通风。

抗污染有效性实验：

1.紫外线照射

对扩增产物有一定的效果。

2.有效氯处理

效果肯定！

但要注意对荧光探针的淬灭！

3.酒精擦拭

无效且容易导致污染物迁移。

4.高压处理

容易导致交叉污染，并可引起器具变形（吸头、离心管）。

（四）污染的预防

1.预防污染的常规工作

1）严格的实验室分区与管理：

物品单独使用的好处

2）经常性实验室通风：

能对流通风的重要性，封闭实验室的弊端。

3）每周有效氯消毒液擦拭:

（84消毒液，健之素等）,桌面、地面清洗

4）每日清水擦拭实验用品：

流水清洁的重要性，对实验用品如试管架、吸头盒、离心机内面等。

5）移液器的处理：

即时进行流水清洗，除非细菌培养实验无需高压和消毒。

2.人员培训与管理

污染环节的认知（按来源分类）,有效预防污染操作的实现，实验室新进人员的培训、考核与上岗。

3.实验室生物废物的管理：

标本接触废物、试剂废物、扩增产物等。