鸡大肠杆菌的分离鉴定及防治研究.docx
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鸡大肠杆菌的分离鉴定及防治研究
第一章引言
大肠杆菌是临床医学中较为常见的一种条件致病菌，被感染的动物会出现败血症、腹膜炎、心包炎、肝周炎、气囊炎、尿道感染和腹泻等症状［1］。
当前抗生素在防治鸡的大肠杆菌病方面具有重要作用。
随着近年来我国养殖业的快速发展，抗菌药物在鸡大肠杆菌临床治疗中应用率越来越明显，然而，由于集约化养殖在主要疫病得到基本控制后，大肠杆菌病有明显的上升趋势；另外滥用抗生素，耐药性菌株越来越多。
有的鸡场在治疗鸡的大肠杆菌病时，即使是交替应用多种抗生素，其治疗效果也不佳，这样既耽误了鸡病的治疗，又浪费了药物，造成了极大的经济损失。
为了准确有效地治疗鸡的大肠杆菌病，我们对规模化白羽肉鸡养殖场鸡大肠杆菌的分离鉴定和耐药性检测结果进行了分析。
从而选择出对大肠杆菌具有高度敏感性的药物，为鸡大肠杆菌病的防治提供理论依据。
第二章材料和方法
2.1试验材料
以福建省某公司96个标准化白羽肉鸡养殖场疑似患大肠杆菌病及疑似大肠杆菌病而死亡的鸡群做病料，分离并培养905份样品。
百炎康、氟苯尼考、优利峰、安普霉素、硫酸新霉素、头孢噻呋、恩诺沙星、多粘菌素、利福平。
培养板（葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、硫化氢、尿素蛋白胨水等生化发酵培养基）购自某生物科技有限公司；柠檬酸盐培养基、葡萄糖蛋白胨水，参照曹澍择等（1992）的方法配制；麦康凯干粉培养基、血清学鉴定所需营养琼脂、普通琼脂、普通肉汤、MH肉汤培养基，均购自某微生物培养基制品厂；LB培养基参照《分子克隆实验指南》[2]上的方法配制。
电子天平、超净工作台和恒温培养箱等。
2.1.1病样的采集
临床表现鸡大肠杆菌病没有特征的临床表现，但与鸡只发病日龄、病程长短、受侵害的组织器官及部位、有无继发或混合感染有很大关系。
初生雏鸡脐炎，俗称＂大肚脐＂。
病鸡精神沉郁，少食或不食，腹部大，脐孔及其周围皮肤发红，水肿。
另外表现为下痢，除精神、食欲差，羽毛松乱、拉稀也可见推出泥土样粪便，明显发病1－2天内可死亡。
病理剖检初生雏鸡脐炎死后可见脐孔周围皮肤水肿、皮下瘀血、出血、水肿，水肿液呈淡黄色或黄红色。
脐孔开张，新生雏以下痢为主的病死鸡以及脐炎致死鸡均可见到卵黄没有吸收或吸收不良，卵囊充血、出血、囊内卵黄液粘稠或稀薄，多呈黄绿色。
肠道呈卡他性炎症。
肝脏肿大，有时见到散在的淡黄色坏死灶，肝包膜略有增厚。
因饲养管理不当引起鸡慢性呼吸道疾病时在肝表面形成的这种纤维素性膜有的呈局部发生，严重的整个肝表面被此膜包裹，此膜剥脱后肝呈紫褐色；心包炎，心包增厚不透明，心包积有淡黄色液体；气囊炎也是常见的变化，胸、腹等气囊囊壁增厚呈灰黄色，囊腔内有数量不等的纤维素性渗出物或干酪样物如同蛋黄。
病料采集及保存采集病变的实质器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织以及关节等），具体采集的病料根据解剖的病变情况而定，选取了典型有代表性的病料（送检病料未做消毒水处理）采集单位填写好委托书（注明场名、取样栋号、鸡的日龄、样品名称及数量，同时要求对临床及剖检发现的病变情况作简要描述）。
病料新鲜时进行，送检时加冰块做低温处理，采用塑料袋包装送检，用完好的塑料袋做4层包装。
2.2方法
2.2.1取样
依据“五点分布”的基本原则[3]，从福建省某公司96个规模化白羽肉鸡养殖场采集的样品放入无菌培养基，共获得905份样品。
2.2.2分离鉴定
对菌落明显的再划线接种于普通琼脂和麦康凯培养基平板上，37℃培养18小时，然后挑取麦康凯琼脂平板上粉红色单个菌落，在麦康凯平板上分区划线，37℃培养18小时，选取单个典型菌落纯培养后冻干保存。
2.3生化试验
取麦康凯琼脂平板上粉红色单个菌落接种于普通肉汤，于37℃培养18小时，对所分离株进行常规生化指标测定，并观察结果。
2.4药敏试验
2.4.1最小抑菌浓度测定方法
菌落悬液配制法：
挑取培养18～24小时的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。
稀释抗菌药物的制备及菌液接种：
取无菌试管（13×100毫米）13支，排成一排，第1管中加入1.6毫升MH肉汤、第13管中加入2毫升MH肉汤作为对照用以对比是否污染，其余每管加入MH肉汤1毫升。
在第1管中加入抗菌药物原液（如1280微克/毫升）0.4毫升混匀，然后吸取1毫升至第2管，混匀后再吸取1毫升至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1毫升弃去，第12管为不含药物的菌液生长对照，此时第1～11管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25微克/毫升。
然后在第1～12管内加入上述制备好的菌液各1毫升，使管内最终菌液浓度约为5×105菌落形成单位/毫升，此时第1～11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125微克/毫升。
塞好试管塞子，置37℃恒温箱中16～24小时后观察结果。
2.4.2抑菌圈试验
根据最小抑菌浓度，用打孔法对上述药液进行抑菌圈试验，置37℃恒温箱中16～24小时后观察结果。
第三章试验结果
3.1细菌分离鉴定
905份病、死鸡病料，共分离出782株细菌，生化鉴定表明其中604株分离株属大肠杆菌。
在麦康凯培养基上生长出边缘整齐、稍隆起、表面光滑湿润、直径1.5～2毫米的红色圆形菌落，革兰氏阴性，镜检可见粗短、两端钝圆的小杆菌，多单个散在，个别成双排列，无芽孢，革兰染色显示为阴性，属于典型的大肠杆菌的形态。
3.2生化试验结果
604个分离株的生化试验结果（表1）为：
均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖；不分解蔗糖、果糖、半乳糖；几乎均不产生硫化氢，不分解尿素，吲哚和甲基红试验均为阳性，VP试验和枸橼酸盐利用试验均为阴性，不液化明胶。
表1604株大肠杆菌的生化试验结果
生化项目
阳性反应
葡萄糖
＋
乳糖
＋
麦芽糖
＋
甘露醇
＋
鼠李糖
＋
山梨醇
＋
M-R
＋
V-P
－
蔗糖
－
果糖
－
半乳糖
－
硫化氢
－
尿素
－
明胶
－
枸橼酸盐
－
3.3药敏试验结果
从观察中具有一定规模的代表性鸡场其中一期病样中分离的5株大肠杆菌，其药敏试验结果见表2。
5个分离株对药物敏感性大致都一致。
表2分离的大肠杆菌的药敏试验结果
药物名称
菌株（M1）
菌株（M2）
菌株（M3）
菌株（M4）
菌株（M5）
结果D（毫米）
最小抑菌浓度（微克/毫升）
抑菌圈（毫米）
最小抑菌浓度（微克/毫升）
抑菌圈（毫米）
最小抑菌浓度（微克/毫升）
抑菌圈（毫米）
最小抑菌浓度（微克/毫升）
抑菌圈（毫米）
最小抑菌浓度（微克/毫升）
抑菌圈（毫米）
恩诺沙星
16
19
16
17
32
16
16
17
32
17
D＞16
头孢噻呋
4
22
8
21
4
22
4
21
8
19
D＞16
庆大霉素
64
10
128
8
64
10
128
6
128
7
D＜11
百炎康
0.25
24
0.5
22
0.5
23
0.5
22
0.25
24
D＞16
硫酸新霉素
8
18
16
16
8
17
16
16
16
16
D＞16
多粘菌素
64
10
128
8
128
7
64
9
128
7
D＜11
氟苯尼考
4
20
8
19
8
18
4
20
4
20
D＞16
安普霉素
16
17
8
19
16
17
8
18
16
17
D＞16
优利峰
64
9
64
7
64
9
4
10
64
9
D＜11
通过最小抑菌浓度的测定，结合中国兽医药品监察所标准以及2009版美国临床实验室标准化委员会（CLSI）制定的相关标准对耐药性进行统计分析[4]，其耐药性判断标准见表3。
表3鸡大肠杆菌耐药性检测结果对比分析判断标准
抗菌药物
耐药（R）/（g/mL）
中介（I）/（g/mL）
敏感（S）/（g/mL）
恩诺沙星
≥16
4
≤2
头孢噻呋
≥8
4
≤4
利福平
≥4
8
≤8
百炎康
≥128
8
≤0.25
硫酸新霉素
≥32
16
≤0.25
多粘菌素
≥2
4
≤8
氟苯尼考
≥8
8
≤4
安普霉素
≥32
64
≤6
优利峰
≥2
-
≤8
第四章分析
4.1药敏试验结果分析
从常见9种药敏试验结果可见，当地的鸡大肠杆菌各种抗生素有不同程度上的耐药性，其中对安普霉素、多粘菌素、优利峰等的耐药性显著偏高，其耐药率分别为80.69%、86.14%、88.54%。
对恩诺沙星、百炎康、硫酸新霉素较敏感，其敏感率分别为38.09%、38.82%、42.49%。
具体结果参见表4。
观察区域的细菌耐药性所涉及的药物非常广，不但对早期使用的药物有很高的耐药性，对临床使用时间不长的药物也有一定的耐药性，前两年临床使用敏感的药物，现在也成为不敏感药物。
临床上长期大量和不规范使用抗菌药物，致使大肠杆菌耐药菌株不断产生，耐药谱也越来越广泛，这提示我们每隔一定时间均要对本地区的大肠杆菌耐药性进行检测，以便更好地选择敏感有效的药物，以控制该病的流行。
表4鸡大肠杆菌耐药性检测结果对比分析
抗菌药物
耐药性（%）
中介率（%）
敏感性（%）
恩诺沙星
52.24
9.67
38.09
头孢噻呋
56.34
9.54
34.12
安普霉素
80.69
14.79
4.52
百炎康
49.98
11.2
38.82
硫酸新霉素
50.12
7.39
42.49
多粘菌素
86.14
9.56
4.3
氟苯尼考
61.09
12.99
25.92
利福平
51.73
26.22
22.05
优利峰
88.54
0
11.46
当前，抗菌药物的使用仍然是有效控制禽大肠杆菌病的手段之一，孵化厂的污染会导致雏鸡早期感染大肠杆菌病。
孵化厂的污染主要是指种蛋在孵化后期和出雏期在孵化箱内、出雏箱内的污染，患病的雏鸡和被污染的蛋壳以及器具等，都可能使新生雏鸡受到感染。
针对这种情况，结合本实验的结果，可在雏鸡出壳24小时之内进行高敏药物的颈部皮下注射，在生产中常用恩诺沙星那5毫克/羽（2毫升/支，1支/40羽份）、头孢噻呋纳1克/2000羽份进行控制白羽肉鸡仔早期大肠杆菌病的发生。
另外，在白羽肉鸡的生长过程中，几种药物的联合运用，也能协同增强抗菌效果，氟苯尼考＋利福平、百炎康＋硫酸新霉素等。
第五章预防
5.1加强饲养管理
有些养殖场在饲养期间不注意养殖场的环境，各方面的消毒卫生也不到位，很容易出现大范围的感染在这种情况下就必须改善鸡舍的卫生条件，平时注意通风，避免并发症，加剧病情。
定期的对鸡场进行打扫和消毒，做到全进全出，每个批次对于鸡的粪便也要及时的进行处理，空栏鸡舍彻底清扫、清洗、消毒（根据长期对福建省某公司96个规模化白羽肉鸡养殖场为观察，集约化养殖场空栏期必须保证四次以上有效的消毒工作才能起到一定的防治效果）。
鸡场的养殖密度也应该合理，高密度的饲养会给鸡场带来更多的危害。
5.2净化饮水
鸡饮用的水源也要重视，最好使用深井地下水。
对于无法使用深井水的鸡场，应该安装水处理系统净化水质并在水中加入适量的氯制剂，既能保证水源的干净，也能对鸡的感染进行预防。
5.3健全兽医卫生防疫制度
根据鸡大肠杆菌病病情发生的现实情况和病情发生的诱因，在对病情预防的时候应该重点考虑对日常鸡场的管理，尤其是在饲养的时候提高管理水平、提供舒适的饲养环境、保证鸡只福利、选择优质的饲料、选择优质的合作伙伴保证药品、疫苗等保证品的品质；积极做好疾病预防措施，控制“人流、车流、物流”的消毒工作，应该全力执行全封闭式管理。
在此同时搞好鸡场环境的卫生工作，对鸡舍要进行定时消毒，人员进入生产区要进行洗澡换衣消毒。
5.4药物预防
不同时期的感染以及感染时间的长短需要治疗的药物也是不同的所以，一旦鸡群出现了疑似大肠杆菌的感染，应该立即进行试验，确定大肠杆菌发病时，根据发病的时间确定药物的使用和治疗的疗程在进行治疗的时候不能仅仅依靠现有的经验进行治疗因为鸡群感染的大肠杆菌抗药性可能在随时的变化，所以在确定之前不应该胡乱的治疗在鸡群疑似大肠杆菌发病时期就必须要进行过敏试验依据实验结果再进行治疗，只有这样，才能够快速高效抑制病菌的继续感染，减少防治损失。
5.5疫苗预防
通过长期对福建省某公司96个规模化白羽肉鸡养殖场为观察对象。
大肠杆菌感染时常在鸡场中时常发生，并常常反复发生。
部分规模化养殖场经过不断的送检确定常发病菌株类型进行大肠杆菌灭活苗免疫实现对大肠杆菌的有效预防。
第六章小结
综上所述，鸡大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的一种常见多发病。
各种日龄的鸡均可感染，但因饲养管理水平、环境卫生、防治措施的效果，有无继发其它疫病等因素的影响。
细菌耐药性所涉及的药物非常广，不但对早期使用的药物有很高的耐药性，临床上大量和不规范使用抗菌药物，致使大肠杆菌耐药菌株不断产生，耐药谱也越来越广泛对临床使用时间不长的药物也有一定的耐药性。
养殖场在日常养殖管理过程中应做到养防结合，防重于治。
健全兽医卫生防疫制度注重生物安全，治疗上谨慎，合理用药，提高药物使用的准确性，避免长时间使用几种或一种药物，以免对治疗效果造成影响。
参考文献：
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190.
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ALaboratoryManual[M].科学出版社，2005.
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75-76.
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1773-1773.
致谢
在这里首先衷心感谢指导老师，在我毕业论文设计和写作中过程中对我的指导和关怀。
无论是试验的设计、操作过程的每一个环节还是论文撰写等，导师都给予了耐心细致的指导，每一点进步和成绩无不凝聚着指导老师的汗水。
导师丰富的理论知识，严谨的教学态度，深邃的科学洞察力，勇于创新的精神以及豁达的人生观，为我树立了典范，使我受益终生。
导渊博的临床知识，敏锐的思维及高度的敬业精神是我在以后得发展道路上永远学习的榜样，特别是严谨的治学态度更是我们的楷模。
在这毕业之际，向导师致以由衷的敬意和真诚的感谢！
最后，再次向在我专科毕业论文写作中付出辛劳的指导老师和帮助我的同学表示衷心的感谢！
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