水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测.docx
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水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
（1）
录入时间:
2010-9-2511:
17:
29来源：
生物信息网
（一）实验目的
（1）了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
（2）学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
（3）学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
（二）实验原理
水是微生物广泛分布的天然环境。
各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中微生物的主要来源有：
水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。
水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落（colony-formingunit，cfu）数，故其单位应是cfu/g（mL）。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数（MPN）表示。
在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。
这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
（三）实验器材
（1）菌落总数的测定：
1）培养基：
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2）器材：
灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
（2）大肠菌群的测定；
1）培养基：
①乳糖胆盐蛋白胨培养基：
蛋白胨20g，猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。
制法：
将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。
双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：
除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。
②伊红美蓝琼脂培养基：
蛋白胨10g，乳糖10g，K2HP042g，2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。
制法：
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
③乳糖发酵管：
除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。
2）器材：
灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四）实验方法
（1）水样的采集：
1）自来水：
先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
2）池水、河水、湖水等地面水源水：
在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。
如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。
（2）细菌总数的测定：
1）水样稀释及培养：
①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：
⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度（饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:
10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:
10、1:
100、1:
1000三种稀释度；污染水—被选择1:
100、1:
1000、1:
10000三种稀释度），吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
2）计算方法：
作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。
3）计数的报告：
①平板菌落数的选择：
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。
如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。
若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
②稀释度的选择：
a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之（表1例1）。
b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。
若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2，则报告其中较小的数字（l例2、例3）。
c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（l例4）。
d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（1例5）。
e.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6）。
f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之（表l例7）。
③细菌总数的报告：
细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。
为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。
（3）大肠菌群的测定（多管发酵法）：
表1稀释度的选择及细菌数报告方式
稀释度及菌落数
两稀释度之比
菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）
报告方式（菌落总数）/（cfu/mL或cfu/g）
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20
-
16400
16000或1.6×104
2
多不可计
295
46
1.6
37750
38000或3.8×104
3
多不可计
271
60
2.2
27100
27000或2.7×104
4
多不可计
多不可计
313
-
313000
310000或3.1×105
5
27
11
5
-
270
270或
6
0
0
0
-
＜10
＜10
7
多不可计
305
12
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
（2）
录入时间:
2010-9-2511:
22:
11来源：
生物信息网
1）生活饮用水或食品生产用水的检验：
①初步发酵试验：
在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液（可称为三倍乳糖胆盐）的三角瓶中（内有倒置杜氏小管），以无菌操作各加水样100mL。
在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中（内有倒置小管），以无菌操作各加入水样10mL。
如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。
摇匀后，37℃培养24h。
②平板分离：
经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMB培养基）上，37℃培养18—24h。
大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
③复发酵试验：
将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
④报告：
根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表2（或表3），报告每升水样中的大肠菌群数（MPN）。
2）水源水的检验：
用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。
①严重污染水：
1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。
②中度污染水：
10．1，0．1，0．01mL各1份。
③轻度污染水：
100，10，1，0．1mL各l份。
④大肠菌群变异不大的水源水：
10mLl0份。
表2大肠菌群检索表（饮用水）
0
1
2
备注
每升水样中大肠菌群数
0
＜3
4
11
接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）
1
3
8
18
2
7
13
27
3
11
18
38
4
14
24
52
5
18
30
70
6
22
36
92
7
27
43
120
8
31
51
161
9
36
60
230
10
40
69
＞230
表3大肠菌群数变异不大的饮用水
阳性管数
0
1
2
3
接种水样总量300mL（3份100mL）
每升水样中大肠菌群数
＜3
4
11
＞18
表4大肠菌群检索表（严重污染水）
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
1
0.1
0.01
0.001
-
-
-
-
＜900
接种水样总量为1.111（1，0.1，0.01，0.001mL各一份）
-
-
-
+
900
-
-
+
-
900
-
+
-
-
950
-
-
+
+
1800
-
+
-
+
1900
-
+
+
-
2200
+
-
-
-
2300
-
+
+
+
2800
+
-
-
+
9200
+
-
+
-
9400
+
-
+
+
18000
+
+
-
-
23000
+
+
-
+
96000
+
+
+
-
238000
+
+
+
+
＞238000
表5大肠菌群检索表（中度污染水）
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
10
1
0.1
0.01
-
-
-
-
＜90
接种水样总量为11.11（10，1，0.1，0.01mL各一份）
-
-
-
+
90
-
-
+
-
90
-
+
-
-
95
-
-
+
+
180
-
+
-
+
190
-
+
+
-
220
+
-
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