无血清培育基与完全培育基体外诱导扩增CIK细胞分泌细胞因子水平的比较.docx

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无血清培育基与完全培育基体外诱导扩增CIK细胞分泌细胞因子水平的比较

无血清培育基与完全培育基体外诱导扩增CIK细胞分泌细胞因子水平的比较

【摘要】目的比较无血清培育基（AIMV）与完全培育基（CM）体外诱导扩增CIK细胞及CIK细胞分泌细胞因子水平。

方式别离用AIMV及完全培育基加入4种细胞因子（IFNγ、IL二、IL1及OKT3）将脐带血单个核细胞（CBMNCs）诱导成CIK细胞，比较细胞的增殖能力、细胞表型及分泌细胞因子水平。

结果与完全培育基比较，无血清培育基培育的CIK细胞增殖顶峰较晚（14～17天）,但增殖倍数高，在细胞表型、分泌细胞因子水平方面两种培育基培育的CIK细胞均无明显的不同（P＞）。

结论无血清培育基可代替完全培育基。

【关键词】无血清培育基免疫细胞培育细胞因子肿瘤

0引言

CIK细胞（Cytokineinducedkiller，CIK）是将人外周血单个核细胞，在体外用多种细胞因子（如IFNγ、IL二、IL1及OKT3等）一路培育一段时间后取得的一群异质细胞。

具有极强的增殖能力及杀伤肿瘤细胞的能力。

Critzapis等[1]报导，CIK细胞分泌多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用从而杀伤肿瘤细胞。

医治所需的CIK细胞在体外培育时所用的条件对细胞的活性有很大影响。

此刻常常利用于细胞培育的完全培育基,因含有人AB血清,虽经HBV、HCV及HIV的检测,但仍有可能传播其他疾病,安全性低;而且存在批次不同、不宜质控，质量不能保证。

无血清培育基则可达到生物干净要求,成份明确,质量稳定,便于质控,克服了人ＡＢ血清的缺点,能减少病人意外感染的机缘，对于免疫医治的推行应用有重要意义。

为此,咱们比较了无血清培育基（ＡＩＭＶ）与完全培育基（含10%胎牛血清RPMI1640）培育CIK细胞分泌细胞因子水平。

1材料与方式

材料

健康足月产胎儿脐带静脉血50ml（枸橼酸钠抗凝）,产妇各项生化指标检测正常。

RPMI1640培育基、淋巴细胞分离液和无血清培育基购自GIBCO公司,细胞因子购自Bioscience公司,流式试剂CD45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC五、CD3FITCCD16+CD56PE和PI染液购自BeckmanColuter公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司。

方式

细胞培育

脐血用淋巴细胞分离液作密度梯度2500r/min离心30min分离的外周血单个核细胞,别离用完全培育基（RPMI1640,含10%胎牛血清,100μｇ/ｍｌ链霉素,100Ｕ/ｍｌ青霉素）和无血清培育基调整细胞数为1×106个/ml,接种于24孔培育板,930μl/孔。

第1天加入rhIFNγ1000u/ml,培育24h后加入rhIL2300u/ml、rhIL1100u/ml及OKT350ng/ml继续培育,每隔4d改换培育基,调细胞数为1×106个/ml,补加rhIL2300u/ml,每8d在补加rhIL2的同时补加OKT350ng/ml。

YTMLC、GLC和A549用含10%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640常规培育。

设不加细胞因子的CBMNCs培育作为对照。

细胞表型分析

于培育的第0、4、八、10、1二、14、17、21d对以上各组效应细胞进行分析,每组每次测4个复孔。

细胞增殖能力测定

于培育的第0、4、八、10、1二、14、17、21d别离取细胞用台盼蓝拒染法计数所培育的活细胞浓度,按照流式检测的CIK的比例，计量液量,推算CIK细胞总数。

CIK细胞分泌IL二、IFNγ、TNFα细胞因子水平测定

于培育的第0、4、八、10、1二、14、17、21d别离取细胞,充分洗涤,调整细胞浓度为2×106/ml培育24ｈ后,搜集上清,用ＥＬＩＳＡ法定量测定细胞培育上清中IL二、IFNγ、TNFα，设4个平行孔。

2结果

ＡＩＭＶ与完全培育基培育CIK细胞增殖能力的比较

实验表明,ＡＩＭＶ培育细胞较完全培育基培育细胞增殖迟缓。

完全培育基增殖顶峰期在第12d，增殖平台为第10～12d，最高增殖倍数为倍；而ＡＩＭＶ培育基增殖顶峰期在第14d，增殖平台为第14～17d，最高增殖倍数为倍。

虽然ＡＩＭＶ培育细胞较完全培育基培育细胞增殖迟缓，但其增殖平台期较长，增殖倍数较完全培育基高，见图1。

图1AIMV与完全培育基培育CIK细胞增殖能力

ＡＩＭＶ与完全培育基培育细胞表型比较

实验结果表明，两种培育基培育的细胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+细胞所占百分比逐渐增多，CD3+CD56+细胞在ＡＩＭＶ培育基中，增加顶峰在14～17d，所占相对百分率由（±）上升为（±）,增加了倍，完全培育基增加顶峰在12～14d，所占相对百分率由（±）上升为（±），增加了倍。

对照组CBMNCs培育体系中未出现明显的细胞表型转化,各类细胞成份均呈递减趋势，见表一、图2。

AIMV与完全培育基培育的CIK细胞分泌细胞因子水平

IL2水平

AIMV与完全培育基培育的CIK细胞均分泌IL12，从第4d分泌量均稳定升高，都于12d达到顶峰，第14d略有下降为，以后逐渐下降。

但AIMV培育基第12d的IL2水平（±）pg/ml明显高于完全培育基培育组（±）pg/ml，且下降水平也慢于CM组，见图3。

A：

培育前；B：

完全培育基培育后；C：

AIMV培育基后表1ＡＩＭＶ与完全培育基培育细胞不同时间的表型转变IFNγ水平

AIMV与完全培育基培育的CIK细胞均分泌IFNγ，在第4dIFNγ水平开始升高，第14～17d分泌量增大，完全培育基培育组第17d达到顶峰为（±）pg/ml，而AIMV组14d达到顶峰（±）pg/ml，顶峰期后均迅速下降，见图4。

TNFα水平

AIMV与完全培育基诱导培育的CIK细胞均分泌TNFα，第4～17dTNFα水平均平稳升高，完全培育基组第17d达到顶峰为（±）pg/ml，第21d略有下降为（±）pg/ml，而AIMV组14d达到顶峰为（±）pg/ml，以后TNFα水平开始下降，见图5。

3讨论

CIK生物免疫医治已作为肿瘤综合医治中的一种重要手腕，能清除恶性肿瘤患者术后、放化疗后微小残留病灶及调节患者的免疫能力。

但此刻用于CIK扩增培育的培育基一般为AB血清培育基，但人ＡＢ血清存在安全性低,不宜质控等缺点,无血清培育基正取得愈来愈普遍的应用。

多数研究表明,无血清培育基可代替含血清的完全培育基,二者所得培育物的数量和功能相当[24];但也有不同的观点,以为应用无血清培育基所得细胞功能受到损害[5,6]。

无血清培育基ＡＩＭＶ是美国Ｇｉｂｃｏ公司专为体外培育淋巴细胞设计的产品,可用于临床实验。

因为人ＡＢ血清存在个体不同、质量不稳定等诸多的不肯定因素,因此咱们选择美国Ｇｉｂｃｏ公司的胎牛血清配制完全培育基作为标准对照,与无血清培育基ＡＩＭＶ作对比，探讨无血清培育基代替完全培育基的可行性。

咱们从细胞增殖能力、细胞表型分析及体外CIK细胞分泌的细胞因子等几个方面进行比较。

在细胞增殖能力方面，虽然ＡＩＭＶ培育基培育的CIK细胞较完全培育基培育细胞增殖迟缓，完全培育基增殖顶峰期在第12天，增殖平台为第10～12天，而ＡＩＭＶ培育基增殖顶峰期在第14天，增殖平台为第14～17天，但ＡＩＭＶ培育基培育的CIK细胞增殖平台期较长，增殖倍数（倍）较完全培育基（倍）高。

这说明无血清培育基支持细胞增殖能力的更为稳定靠得住，也提示利用不同的培育基在回输时间上应有所区别。

在两种培育基培育单个核细胞诱导增殖的进程中，各细胞表型虽在培育进程中有必然的不同，但在增殖顶峰期无明显不同。

CIK细胞具有较强的杀瘤活性，其作用可能与其在增殖进程中能分泌某些细胞因子有关，其主要效应细胞为CD3+CD56+细胞，并出现大量增殖，Lopez等[7]发现CD56+细胞能高表达IFNγ和TNFα，Hoyle等[8]用FACS检测到CIK细胞能表达IL二、IFNγ及TNFα，这与咱们的研究结果:

CIK在体外诱导培育进程中能分泌IL二、IFNγ、TNFα一致。

细胞因子在抗肿瘤的网络调控机制超级复杂，IL二、IFNγ、TNFα在体内外抗肿瘤的进程起着重要的抗肿瘤及调节机体免疫功能的作用。

分泌IL2，从第4天分泌量均稳定升高，都于12天达到顶峰，以后逐渐下降。

但AIMV培育基第12天的IL2水平（±）pg/ml明显高于完全培育基组（±）pg/ml，下降水平也慢于CM组；IFNγ水平在第4天均开始升高，第14～17天分泌量增大，完全培育基组第17天达到顶峰为（±）pg/ml，而AIMV组14天达到顶峰（±）pg/ml；而TNFα，第4～17天TNFα水平均平稳升高，完全培育基组第17天达到顶峰为（±）pg/ml，而AIMV组14天达到顶峰为（±）pg/ml。

可见，无论是AIMV培育基仍是完全培育基其分泌细胞因子的趋势是一致的，只是分泌IFNγ、TNFα水平AIMV培育基（14天）较全培育基（17天）早，但分泌水平无明显不同（P>）。

AIMV培育基分泌细胞因子顶峰与CIK效应细胞CD3+CD56+细胞增殖顶峰一致（14天），因CIK细胞回输时间最好应为在CIK细胞增殖顶峰及细胞因子分泌顶峰时，这有利于发挥其最佳疗效，从这方面考虑，AIMV培育基优于全培育基。

咱们的实验表明，无血清培育基成份明确,来源稳定,功能靠得住,易于质控，有利于保障患者医治的安全。

可完全替代完全培育基，避免没必要要的医疗纠纷，因此在生物医治中有庞大的优势和广漠的应用前景。

【参考文献】

［1］CritzapisAD,DimitroulopoulosD,ParaskevasE,etal.LargescaleexpansionofCD3+CD56+lymphocytescapableoflyingautologoustumorcellswithcytokinerichsupernatants\[J\].CancerImmunolImmunother,2002,51（8）:

440448.

［2］LefebvreP,WinterJN,KahnLE,etal.Megakaryocyteexvivoexpansionpotentialofthreehematopoieticsourcesinserumandserumfreemedium\[J\].JHematother,1999,8

（2）:

199208.

［3］BulterM,BurgenerA,PatrickM,etal.ApplicationofaserumfreemediumforthegrowthofVerocellsandtheproductionofreovirus\[J\].BiotechnolProg,2000,16（5）:

854858.

［4］KambeN,KambeM,ChangHW,etal.Animprovedprovedprocedureforthedevelopmentofhumanmastcellsfromdispersedfetallivercellsinserumfreeculturemedium\[J\].JImmunolMethods,2000,240（12）:

101110.

［5］SekharM,YuJM,SomaT,etal.Murinelongtermrepopulatingabilityiscompromisedbyexvivocultureinserumfreemediumdespitepreservationofcommittedprogenitors\[J\].JHematother,1997,6（6）:

543549.

［6］SluntJB,TaketomiEA,PlattsMillsTA,etal.HumanTcellresponsestoTrichopytontonsurans:

InhibitionusingtheserumfreemediumAimV\[J\].ClinExpAllergy,1997,27（10）:

11841192.

［7］LopezRD,WallerEK,LuPH,etLFA3andIL12providedebyactivatedmonocytesarecriticalintheinvitroexpansionofCD56+Tcells\[J\].cancerImmunolImmunot,2001,49（12）:

629640.

［8］HoyleC,BangsCD,ChangP,etal.ExpansionofPhiladelphiachromosomeNegativeCD3+CD56+cytotoxiccellsfromchronicmyeloidleukemiapatients:

invirtoandinvivoefficacyinseverecombinedimmunodeficiencydiseasemice\[J\].Blood,1998,92（9）:

33183327.