无血清培育基与完全培育基体外诱导扩增CIK细胞分泌细胞因子水平的比较.docx

1、无血清培育基与完全培育基体外诱导扩增CIK细胞分泌细胞因子水平的比较无血清培育基与完全培育基体外诱导扩增 CIK细胞分泌细胞因子水平的比较【摘要】 目的 比较无血清培育基（AIMV）与完全培育基（CM）体外诱导扩增CIK细胞及CIK细胞分泌细胞因子水平。方式 别离用AIMV及完全培育基加入4种细胞因子(IFN 、IL 二、IL 1及OKT3)将脐带血单个核细胞(CBMNCs)诱导成CIK细胞，比较细胞的增殖能力、细胞表型及分泌细胞因子水平。结果 与完全培育基比较，无血清培育基培育的CIK细胞增殖顶峰较晚(1417天),但增殖倍数高，在细胞表型、分泌细胞因子水平方面两种培育基培育的CIK细胞均无

2、明显的不同（P）。结论 无血清培育基可代替完全培育基。 【关键词】 无血清培育基 免疫 细胞培育 细胞因子 肿瘤 0 引言 CIK细胞（Cytokine induced killer，CIK）是将人外周血单个核细胞，在体外用多种细胞因子（如IFN 、IL 二、IL 1及OKT3等）一路培育一段时间后取得的一群异质细胞。具有极强的增殖能力及杀伤肿瘤细胞的能力。Critzapis等1报导，CIK细胞分泌多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用从而杀伤肿瘤细胞。医治所需的CIK细胞在体外培育时所用的条件对细胞的活性有很大影响。此刻常常利用于细胞培育的完全培育基,因含有人AB血清,虽经HBV、H

3、CV及HIV的检测,但仍有可能传播其他疾病,安全性低;而且存在批次不同、不宜质控，质量不能保证。无血清培育基则可达到生物干净要求,成份明确,质量稳定,便于质控,克服了人血清的缺点,能减少病人意外感染的机缘，对于免疫医治的推行应用有重要意义。为此,咱们比较了无血清培育基（）与完全培育基(含10%胎牛血清RPMI 1640)培育CIK细胞分泌细胞因子水平。 1 材料与方式 材料 健康足月产胎儿脐带静脉血50ml(枸橼酸钠抗凝),产妇各项生化指标检测正常。RPMI1640培育基、淋巴细胞分离液和无血清培育基购自GIBCO公司,细胞因子购自Bioscience公司, 流式试剂CD45 FITC/CD4

4、 PE/CD8 ECD/CD3 PC五、CD3 FITC CD16+CD56 PE和PI染液购自Beckman Coluter公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司。 方式 细胞培育 脐血用淋巴细胞分离液作密度梯度2500r/min离心30min分离的外周血单个核细胞, 别离用完全培育基(RPMI 1640,含10%胎牛血清,100/链霉素,100/青霉素)和无血清培育基调整细胞数为1106个/ml,接种于24孔培育板,930l/孔。第1天加入rhIFN 1 000u/ml,培育24h后加入rhIL 2 300u/ml、rhIL 1 100u/ml及OKT 350ng/ml继续培育,每隔4d

5、改换培育基,调细胞数为1106个/ml,补加rhIL 2 300u/ml,每8d在补加rhIL 2的同时补加OKT 350ng/ml。YTMLC、GLC和A549用含10%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100g/ml链霉素的RPMI 1640常规培育。设不加细胞因子的CBMNCs培育作为对照。 细胞表型分析 于培育的第0、4、八、10、1二、14、17、21d对以上各组效应细胞进行分析,每组每次测4个复孔。 细胞增殖能力测定 于培育的第0、4、八、10、1二、14、17、21d别离取细胞用台盼蓝拒染法计数所培育的活细胞浓度,按照流式检测的CIK的比例，计量液量,推算CIK细胞总数。 CIK

6、细胞分泌IL 二、IFN 、TNF 细胞因子水平测定 于培育的第0、4、八、10、1二、14、17、21d别离取细胞,充分洗涤,调整细胞浓度为2106/ml培育24后,搜集上清,用法定量测定细胞培育上清中IL 二、IFN 、TNF ，设4个平行孔。 2 结果 与完全培育基培育CIK细胞增殖能力的比较 实验表明,培育细胞较完全培育基培育细胞增殖迟缓。完全培育基增殖顶峰期在第12d，增殖平台为第1012d，最高增殖倍数为倍；而培育基增殖顶峰期在第14d，增殖平台为第1417d，最高增殖倍数为倍。虽然培育细胞较完全培育基培育细胞增殖迟缓，但其增殖平台期较长，增殖倍数较完全培育基高，见图1。 图1 A

7、IMV与完全培育基培育CIK细胞增殖能力 与完全培育基培育细胞表型比较 实验结果表明，两种培育基培育的细胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+细胞所占百分比逐渐增多，CD3+CD56+细胞在培育基中，增加顶峰在1417d，所占相对百分率由（）上升为（）,增加了倍，完全培育基增加顶峰在1214d，所占相对百分率由（）上升为（），增加了倍。对照组CBMNCs培育体系中未出现明显的细胞表型转化,各类细胞成份均呈递减趋势，见表一、图2。 AIMV与完全培育基培育的CIK细胞分泌细胞因子水平 IL 2水平 AIMV与完全培育基培育的CIK细胞均分泌IL 12，从第4d分泌量均稳定升高，都于12d达到顶

8、峰，第14d略有下降为，以后逐渐下降。但AIMV培育基第12d的IL 2水平（）pg/ml明显高于完全培育基培育组（）pg/ml，且下降水平也慢于CM组，见图3。 A：培育前；B：完全培育基培育后；C：AIMV培育基后表1 与完全培育基培育细胞不同时间的表型转变 IFN 水平 AIMV与完全培育基培育的CIK细胞均分泌IFN ，在第4d IFN 水平开始升高，第1417d分泌量增大，完全培育基培育组第17d达到顶峰为（） pg/ml，而AIMV组14d达到顶峰（）pg/ml，顶峰期后均迅速下降，见图4。 TNF 水平 AIMV与完全培育基诱导培育的CIK细胞均分泌TNF ，第417dTNF 水

9、平均平稳升高，完全培育基组第17d达到顶峰为（） pg/ml，第21d略有下降为（）pg/ml，而AIMV组14d达到顶峰为（）pg/ml，以后TNF 水平开始下降，见图5。 3 讨论 CIK生物免疫医治已作为肿瘤综合医治中的一种重要手腕，能清除恶性肿瘤患者术后、放化疗后微小残留病灶及调节患者的免疫能力。但此刻用于CIK扩增培育的培育基一般为AB血清培育基，但人血清存在安全性低,不宜质控等缺点,无血清培育基正取得愈来愈普遍的应用。多数研究表明,无血清培育基可代替含血清的完全培育基,二者所得培育物的数量和功能相当2 4;但也有不同的观点,以为应用无血清培育基所得细胞功能受到损害5,6。无血清培育

10、基是美国公司专为体外培育淋巴细胞设计的产品,可用于临床实验。因为人血清存在个体不同、质量不稳定等诸多的不肯定因素,因此咱们选择美国公司的胎牛血清配制完全培育基作为标准对照,与无血清培育基作对比，探讨无血清培育基代替完全培育基的可行性。 咱们从细胞增殖能力、细胞表型分析及体外CIK细胞分泌的细胞因子等几个方面进行比较。在细胞增殖能力方面，虽然培育基培育的CIK细胞较完全培育基培育细胞增殖迟缓，完全培育基增殖顶峰期在第12天，增殖平台为第1012天，而培育基增殖顶峰期在第14天，增殖平台为第1417天，但培育基培育的CIK细胞增殖平台期较长，增殖倍数（倍）较完全培育基（倍）高。这说明无血清培育基支

11、持细胞增殖能力的更为稳定靠得住，也提示利用不同的培育基在回输时间上应有所区别。在两种培育基培育单个核细胞诱导增殖的进程中，各细胞表型虽在培育进程中有必然的不同，但在增殖顶峰期无明显不同。 CIK细胞具有较强的杀瘤活性，其作用可能与其在增殖进程中能分泌某些细胞因子有关，其主要效应细胞为CD3+CD56+细胞，并出现大量增殖，Lopez等7发现CD56+细胞能高表达IFN 和TNF ，Hoyle等8用FACS检测到CIK细胞能表达IL 二、IFN 及TNF ，这与咱们的研究结果:CIK在体外诱导培育进程中能分泌IL 二、IFN 、TNF 一致。细胞因子在抗肿瘤的网络调控机制超级复杂，IL 二、IF

12、N 、TNF 在体内外抗肿瘤的进程起着重要的抗肿瘤及调节机体免疫功能的作用。分泌IL 2，从第4天分泌量均稳定升高，都于12天达到顶峰，以后逐渐下降。但AIMV培育基第12天的IL 2水平（）pg/ml明显高于完全培育基组（）pg/ml，下降水平也慢于CM组；IFN 水平在第4天均开始升高，第14 17天分泌量增大，完全培育基组第17天达到顶峰为（） pg/ml，而AIMV组14天达到顶峰（）pg/ml；而TNF ，第417天TNF 水平均平稳升高，完全培育基组第17天达到顶峰为（） pg/ml，而AIMV组14天达到顶峰为（）pg/ml。可见，无论是AIMV培育基仍是完全培育基其分泌细胞因子

13、的趋势是一致的，只是分泌IFN 、TNF 水平AIMV培育基（14天）较全培育基（17天）早，但分泌水平无明显不同（P>）。AIMV培育基分泌细胞因子顶峰与CIK效应细胞CD3+CD56+细胞增殖顶峰一致（14天），因CIK细胞回输时间最好应为在CIK细胞增殖顶峰及细胞因子分泌顶峰时，这有利于发挥其最佳疗效，从这方面考虑，AIMV培育基优于全培育基。 咱们的实验表明，无血清培育基成份明确,来源稳定,功能靠得住,易于质控，有利于保障患者医治的安全。可完全替代完全培育基，避免没必要要的医疗纠纷，因此在生物医治中有庞大的优势和广漠的应用前景。【参考文献】 1 Critzapis A D, Di

14、mitroulopoulos D, Paraskevas E, et al. Large scale expansion of CD3+CD56+ lymphocytes capable of lying autologous tumor cells with cytokine rich supernatantsJ. Cancer Immunol Immunother,2002,51(8):440 448.2Lefebvre P, Winter J N, Kahn L E, et al. Megakaryocyte ex vivo expansion potential of three he

15、matopoietic sources in serum and serum free medium J. J Hematother,1999,8（2）:199 208.3Bulter M, Burgener A, Patrick M, et al .Application of a serum free medium for the growth of Vero cells and the production of reovirusJ.Biotechnol Prog,2000,16（5）:854 858.4Kambe N, Kambe M, Chang HW, et al. An impr

16、oved proved procedure for the development of human mast cells from dispersed fetal liver cells in serum free culture medium J. J Immunol Methods, 2000,240（1 2）:101 110.5Sekhar M, Yu JM, Soma T, et al. Murine long term repopulating ability is compromised by ex vivo culture in serum free medium despit

17、e preservation of committed progenitorsJ. J He matother, 1997,6（6）:543 549.6Slunt JB, Taketomi EA, Platts Mills TA, et al. Human T cell responses to Trichopyton tonsurans: Inhibition using the serum free medium Aim VJ. Clin Exp Allergy, 1997,27（10）:1184 1192.7Lopez R D, Waller E K, Lu P H,et LFA 3 a

18、nd IL 12 providede by activated monocytes are critical in the in vitro expansion of CD56+ T cellsJ. cancer Immunol Immunot,2001,49(12):629 640.8Hoyle C, Bangs C D, Chang P, et al. Expansion of Philadelphia chromosome Negative CD3+CD56+ cytotoxic cells from chronic myeloid leukemia patients :in virto and in vivo efficacy in severe combined immunodeficiency disease mice J.Blood,1998,92(9):3318 3327.