免疫相关基因报告5.docx

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免疫相关基因报告5

蝙蝠蛾免疫相关基因分析报告

2015-7-6

1.分析方法

1.1.查找基因名（由于给予的大部分关键词为简写，因此需要查找基因名）

1.1.1.在Uniprot中输入简写名称

1.1.2.查看每个简写对应的基因的功能及GO注释

1.1.3.选取与免疫相关的基因

1.1.4.若Uniprot中没有，则在KEGG和NCBI中查找

1.2.补充免疫相关基因

1.2.1.通过以下关键词在Uniprot中查找免疫基因

1.2.1.1.Antimicrobialhumoralresponse

1.2.1.2.Antimicrobialpeptidesecretion

1.2.1.3.AntimicrobialpeptideProduction

1.2.1.4.Antimicrobialpeptidebiosyntheticprocess

1.2.1.5.Immunecomplexformation（antibody-mediatedagglutination）

1.2.1.6.Coagulation且immuneresponse

1.2.1.7.Bloodcoagulation且immuneresponse

1.2.1.8.Hemolymphcoagulation且immuneresponse

1.2.1.9.Regulationofcoagulation且immuneresponse

1.2.1.10.Phagocytosis且immuneresponse

1.2.1.11.Defenseresponsetofungus

1.2.1.12.Antifungalhumoralresponse

1.2.1.13.Antifungalpeptidesecretion

1.2.1.14.AntifungalpeptideProduction

1.2.1.15.Tollsignalingpathway且immuneresponse

1.2.1.16.Innateimmuneresponse且immuneresponse

1.2.1.17.JAK-STATcascade且immuneresponse（141）

1.2.1.18.MAPKcascade且immuneresponse（139）

1.2.1.19.PiRNAmetabolicprocess且immuneresponse（0）

1.2.1.20.PiRNAcatabolicprocess且immuneresponse（0）

1.2.1.21.PiRNAbinding且immuneresponse（0）

1.2.1.22.SiRNAbinding且immuneresponse（0）

1.2.1.23.RNAinterference且immuneresponse（0）

1.2.1.24.MiRNAmetabolicprocess且immuneresponse（0）

1.2.1.25.miRNAcatabolicprocess且immuneresponse（0）

1.2.1.26.MiRNAtransport且immuneresponse（0）

1.2.1.27.MiRNAbinding且immuneresponse（0）

1.2.1.28.Autophagy且immuneresponse（134）

1.2.1.29.Apototic且immuneresponse（124）

1.2.1.30.Catalysisoffreeredicalformation且immuneresponse（0）

1.3.别名查找

1.3.1.首先在Uniprot、KEGG、NCBI查找

1.3.2.找不到则在知网、Google中查找

1.3.3.列出别名

1.4.免疫基因拷贝数统计

1.4.1.基因拷贝查找：

用不同的别名，通过excel公式index和match在Swissprot及trembl结果中进行匹配，

1.4.1.1.能够直接在数据库中搜索到的，将不同库的拷贝数分别列出，合并同一数据库的有别名的基因的拷贝数。

1.4.1.2.无法用公式匹配的，进行手动查询：

减少关键词，特别是标点符号，再次在12个物种基因集中进行搜索，得到的结果按照上面方式处理。

1.4.2.整合两个数据库的结果：

两个数据库的注释结果存在一定差异，需要整合，方法如下（较为耗时）：

1.4.2.1.若Swissprot及Trembl中得到的结果相同（基因ID及基因数量），则该结果保留，作为目标基因的拷贝数。

1.4.2.2.若Swissprot及Trembl得到的结果不同（基因ID同的保留），则不同的基因还需要通过BLAST来确定（swissprot与Trembl注释方法与同源搜索方法不同，可以互相验证）：

1.4.2.2.1.若BLAST结果与两个注释结果中的一个吻合，则可确定待查基因为目标基因，目标基因拷贝数+1；

1.4.2.2.2.若BLAST结果与两个注释结果均不吻合，则舍弃该基因。

1.4.2.3.合并以上结果，得到最后的基因拷贝数

1.5.GO分析

1.5.1.不同基因的GO注释下载（无南极蚊）

1.5.2.设计excel公式对GO表格进行重新编排，经过验证，公式无误：

D=LEFT（PHONETIC（INDIRECT（"b"&MATCH（C1,A:

A,0）&":

b"&MATCH（C1,A:

A,0）+COUNTIF（A:

A,C1）-1））,LEN（PHONETIC（INDIRECT（"b"&MATCH（C1,A:

A,0）&":

b"&MATCH（C1,A:

A,0）+COUNTIF（A:

A,C1）+1）））+1）

1.5.3.使用WEGO进行图像可视化

1.5.3.1.总览

1.5.3.2.昆虫有与昆虫没有的比较

1.5.3.3.蝙蝠蛾，昆虫和所有物种比较

1.6.Ipath分析

1.6.1.提取蝙蝠蛾免疫基因的KO号

1.6.2.在Ipath中进行绘图

1.6.2.1.仅免疫基因的图

1.6.2.2.免疫及低氧基因的图

1.7.特有、扩张基因的进化分析

1.7.1.序列提取

1.7.1.1.蝙蝠蛾特有基因分析：

在NCBI中进行BLAST分析，找到相似性最高的蛋白序列，并在Uniprot中提取与该基因同源的蛋白序列

1.7.1.2.蝙蝠蛾扩张基因分析：

通过提取6种昆虫或12物种的对应蛋白序列，若序列少，则在Uniprot中提取同源蛋白序列

1.7.2.进化树构建

1.7.2.1.软件：

MEGA6.06

1.7.2.2.参数：

默认

1.7.3.结构分析

1.7.3.1.结构域预测（Iprscan，华大数据）

1.7.3.2.信号肽预测（SignalP）

1.7.3.3.跨膜结构预测（TMHMM）

1.8.转录组分析（略）

2.分析结果

2.1.免疫基因关键词

以韩老师提供的免疫途径及基因为主体，利用GO及NCBI的数据进行补充，得到免疫基因2446个：

2.2.蝙蝠蛾及其他物种免疫基因统计

不同途径在不同物种中的免疫基因统计如下：

结果显示，蝙蝠蛾17个免疫途径，涉及基因370个，共677个拷贝。

在动物抗真菌蛋白途径较其他11个物种要多；而细胞免疫途径、JAK/STAT途径和免疫相关的细胞凋亡途径则较其他5种昆虫要多。

并没有发现明显收缩的途径。

2.3.蝙蝠蛾基因组特有、扩张和共有的免疫基因

2.3.1.十二个物种特有、扩张及共有的免疫基因统计

Pathway

H.armoricanus

P.xylostella

B.mori

D.plexippus

B.antarctica

D.melanogaster

C.elegans

S.cerevisiae

B.mutus

D.rerio

M.musculus

H.sapiens

Specific

Expansive

229

Common

Totalgenefamilies

239

224

229

243

217

259

175

404

326

398

425

Totalgenes

370

316

340

360

306

401

274

106

912

715

969

1030

Totalcopys

677

659

575

590

500

638

495

160

1144

1156

1167

1330

%ingenome

3.54

3.65

3.93

3.64

3.70

4.58

2.42

2.39

4.46

4.37

5.26

6.05

%ofannotation*

100

将部分分成3个层次进行分析：

基因家族，基因和基因拷贝。

结果显示，蝙蝠蛾特有的免疫基因8个，扩张的免疫基因共38个。

在6种昆虫中，特有基因总数较小菜蛾、果蝇要少，而扩张基因数目明显少于小菜蛾（哪个途径？

），但多于其余4种昆虫（哪个途径？

）。

12物种共有基因35个，而6个昆虫物种中，共有基因195个。

蝙蝠蛾免疫基因占基因组的3.54%，除了线虫和酵母，均低于其他物种所占比例。

2.4.特有、扩张及共有基因

17个免疫途径中，蝙蝠蛾与12/6个物种比较，得到的特有、扩张和共有基因数量统计如下表：

Pathway

Specificgene

Expansivegene

Commongene

12sp

6sp

12sp

6sp

12sp

6sp

Antimicrobialpeptides

Agglutination

Coagulation

Phagocytosis

Antifungalproteinsfromplants

Antifungalproteinsfromanimal

Tollpathwaygenes

IMDpathwaygenes

Cellularinnateimmuneresponse

JAK/STATpathway

MAPK/JNK-p38

Pi/siandmi-RNApathway

Autophagy

Apoptosis

Freeradicaldefense

Apoptosis-inducingantifungalpeptides

Others

Total

197

*Sp：

Species

2.4.1.特有和扩张基因

12个物种比较，蝙蝠蛾的免疫相关特有及扩张基因，主要来自细胞免疫类（13个），体液免疫的Toll途径（5个）和抗菌肽相关基因（6个）等。

6个物种比较，蝙蝠蛾免疫相关特有及扩张基因，同样集中于细胞免疫（17个），体液免疫的Toll途径（6个）和抗菌肽相关基因（7个）。

这些途径特别是Toll途径可能在蝙蝠蛾抵抗外来物入侵的时候起着特别重要的作用（但细胞免疫和抗菌肽相关基因也可能由于关键词数量基数较大而导致在这两个途径预测到的扩张基因相对较多）

2.4.2.共有基因

12个物种比较，共有基因35个（Tab12，sheet5），集中于细胞免疫（17个）、自噬（6个）和自由基抵抗（6个）；6个物种比较，共有基因197个，集中于细胞免疫（78个）、吞噬（18个）、自噬（15个）和抗菌肽（13个）。

可见，在不同的物种中，体液免疫和自噬途径的共有基因均较多，推测这两个途径在不同物种中进化上较为保守；而抗菌肽，吞噬相关和抗真菌类别等14个途径，在昆虫中进化较为保守，在在其他不同物种中进化并不保守；凝集相关基因（Agglutination）在12个物种和6种昆虫中均不存在共有基因，推测凝集相关的免疫途径在进化中并不保守（但也可能是凝集相关基因用于搜索的关键词较少而导致）。

2.5.较为特别的基因

2.5.1.仅蝙蝠蛾与其他非昆虫（非鳞翅目）物种有

29个基因在除蝙蝠蛾外的鳞翅目昆虫中缺失，其中14个在昆虫中缺失：

推测蝙蝠蛾可能保留了或进化出一些非昆虫（非鳞翅目）的免疫途径。

2.5.2.其他物种或鳞翅目有，蝙蝠蛾没有

16个基因在鳞翅目昆虫或其他昆虫中存在，但在蝙蝠蛾中缺失

2.6.GO分析

2.7.路径分析

2.7.1.代谢途径

2.7.2.调控途径

2.7.3.次生物质合成途径

2.8.蝙蝠蛾免疫途径基因分析

昆虫并没有类似于哺乳类动物的获得性免疫系统，只有先天性免疫系统来抵御各种微生物的入侵。

先天性免疫系统主要包括体液免疫和细胞免疫。

其中由昆虫脂肪体合成和分泌抗菌肽而形成的体液免疫比细胞免疫更快更早地产生防御。

抗菌肽的合成由两种不同的信号途径调节：

Toll信号途径和Imd信号途径，它们分别介导合成不同的抗菌肽，Toll信号途径能够介导机体对入侵的病原真菌和革兰氏阳性细菌的感染快速地产生相应的抗菌肽；而Imd信号途径则主要对革兰氏阴性菌进行免疫应答。

细胞免疫涉及了3种血细胞：

浆细胞、薄层细胞和晶体细胞。

其中浆细胞负责吞噬死亡细胞和感染细胞；薄层细胞主要包裹大的凋亡组织和外来物；而晶体细胞提供黑化作用的酶：

酚氧化酶，介导黑化作用，通过黑化作用可以促进伤口愈合修复，组织因血淋巴过多流失而死亡。

体液免疫：

2.8.1.识别基因

体液免疫涉及多个信号途径如Toll和Imd等多个信号途径，研究显示，这些途径的部分识别基因在不同途径均发挥着重要识别作用。

2.8.1.1.PGRP

负责识别PAMPs的PGRP基因有2类，分别为PGRP-S（短序列PGRP）和PGRP-L（长序列PGRP），由于华大的注释结果不能区分以上两种PGRP，因此需要进行结构和进化分析。

结构分析如下图：

结果显示，蝙蝠蛾的13个PGRP中，PGRP-L和PGRP-S分别为10个和3个。

其中5个PGRP-L含有跨膜结构（TM），其中3个分别为PGRP-LF、PGRP-LC1和PCRP-LC2，而余下的两个分类未知，命名为PGRP-Lx1和PGRP-Lx2；5个PGRP-L不含TM，是蝙蝠蛾扩张基因PGRP-LB，但PGRP-LB3和PGRP-LB5缺失了N端；蝙蝠蛾的PGRP-S基因共3个拷贝，N端含有信号肽。

进化树显示，蝙蝠蛾的5个PGRP-LB在进化树上成簇分布，属于扩张基因与其他鳞翅目昆虫的PGRP-LB距离较远，但与双翅目果蝇的进化距离较近。

HaPGRP-LB2和HaPGRP-LB1形成单进化枝，互为旁系同源物，分布于同一scaffold中，物理距离很近，推测经历了一次基因复制事件；类似地，推测HaPGRP-LB4同样经历了一次基因复制事件。

HaPGRP-Lx1和HaPGRP-Lx2互为旁系同源物，和其他鳞翅目PGRP基因的进化距离较近，而HaPGRP-LC1和HaPGRP-LC2互为旁系同源物，与双翅目昆虫PGRP基因距离较近，3个短PGRP-S成簇分布，经历了基因复制事件。

暗示蝙蝠蛾不同亚族的PGRP有着不同的进化方式，即已知分类的PGRP-LB，PGRP-LC、PGRP-LF和PGRP-S进化方式类似双翅目，而未知分类的PGRP-Lx则类似鳞翅目。

表达谱显示，蝙蝠蛾的2个PGRP-LC基因在不同时期有小量表达，但均不响应PH和QH的感染；PGRP-LF在不同发育时期均有少量表达，不响应机体损伤（注射PBS），但在PH或QH感染后，则上调表达；与其他鳞翅目昆虫同源性较高的PGRP-Lx在不同发育时期均不表达，但在机体损伤后明显上调，在PH和QH感染后1~3日明显下调表达，而QH感染后15日则恢复原有水平；PGRP-LB1、PGRP-LB2、PGRP-LB3和PGRP-LB5在各个龄期均有一定表达，其中PGRP-LB1和PGRP-LB5在虫体损伤后下调表达（？

）（PBS注射的样品没有表达，但发育表达谱表达），并不响应PH或QH的感染；PGRP-LB2不响应损伤反应，但在PH或QH感染后明显下调表达（本底水平不高）；PGRP-LB4在机体损伤后大量上调表达，而在PH感染后1d下调表达，QH感染后无变化；PGRP-LB3在各个龄期均不表达，不响应损伤反应和PH或QH的感染，而从结构上该基因少了N端，推测PGRP-LB3为假基因。

3个短序列PGRP在各个龄期均有较高的表达，PGRP-S1（在损伤后下调表达？

），不响应PH或QH的感染；PGRP-S2和PGRP-S3在机体损伤后上调表达，在PH感染后3d上调，而QH感染后表达水平没变化。

2.8.2.Toll信号途径

Toll途径主要介导真菌和革兰氏阳性菌的先天性免疫反应，导致部分抗菌肽（AMPs）的转录。

昆虫受到微生物感染时，机体通过PGRP-SA和GNBP-1复合物与病原相关的分子模式（PAMPs）结合而促发淋巴液中一系列的酶解反应，Spatzle被激活，Toll受体的膜外结构域只与Spatzle蛋白的成熟体有高亲和性。

当被活化的Spatzle结合到Toll受体细胞外部分后，Toll受体细胞内的结构域招募MyD88、Tube和Pelle形成异源三聚体，引起胞内的级联反应[1]，最终使cactus泛素化和磷酸化而降解,释放出类似于NF-κB样蛋白的核转录因子Dorsal和Dif蛋白[2,3]。

激活的Dorsal和Dif蛋白进入细胞核调节抗菌肽基因的表达，其中Dorsal蛋白在胚胎发育时调控胚胎背腹轴发育，而Dif蛋白是在受到到微生物感染的时候才被激活，调控抗菌肽基因转录表达。

另一个高度保守的Pelle/IRAK相互作用蛋白Pellino被证明作为Toll信号通路的正调控因子，能够泛素化Pelle[4]。

蝙蝠蛾中，TLR2、Pellion、和Dorsal属于扩张基因家族。

以下为蝙蝠蛾Toll途径相关基因的发育表达谱，以及PH和QU真菌感染后的表达谱

Toll途径基因中，负责识别病原菌的基因GNBP，PGRP表达量相对较高，而其余大部分Toll途径的基因表达水平均较低。

蝙蝠蛾另外两个PGRP基因：

HaPGRP1和HaPGRP2，前者在各个龄期有一定表达，而后者没有表达。

HaPGRP1在PH感染3天后上调表达，后者没反应。

而HaPGRP-a和HaPGRP2感染后均下调表达，QH感染则没有反应。

HaGNBP-a和HaGNBP-b，在冬虫夏草菌感染后上调表达，而HaGNBP-e则对两种真菌均显示出上调表达。

HaSpatzle-b在PH感染后上调表达。

8个Toll基因拷贝在正常情况下低表达，而在PH感染后，HaTL-c、HaTL-e和HaTL-g均上调表达；而在QH感染后，HaTL-d和HaTL-f均上调表达；相反，TL-a和TL-b则下调表达，而TL-h没有反应。

推测蝙蝠蛾用不同的拷贝来抵御烈性真菌和温和真菌。

蝙蝠蛾缺乏3聚体中的Tube基因，而Myd88和Pelle在普通情况下表达量均较低，主要在卵期和雌性成虫期表达。

二者均不响应PH和QH的感染。

Cactus基因在各个龄期均有一定表达，主要集中在3龄幼虫和成虫期。

该基因在Toll信号途径开启的情况下会被水解，从而释放Dorsal和Dif，蝙蝠蛾的cactus在PH和QH感染后表达水平上调，但是在蛋白水平否被水解则未知。

蝙蝠蛾中，Dif缺失，但Dorsal基因为扩张基因，共3个拷贝，其中HaDorsal-a不表达，HaDorsal-b表达量较低，HaDorsal-c在卵期和雌性成虫期高表达，在PH和QH后，HaDorsal-a呈现出上调表达。

推测HaDorsal-a参与了蝙蝠蛾的真菌免疫应答，而HaDorsal-b和HaDorsal-c则可能参与了背腹部中轴的形成等发育过程。

toll样受体（TLR），是哺乳动物中与Toll受体同源的基因,信号途径和昆虫的Toll信号途径相似，都能激活下游的NF-κB样转录因子。

蝙蝠蛾中也有少量TLR基因，其中TLR2、TLR2-1和TLR2-2为蝙蝠蛾特有基因，能结合TLR6识别肽聚糖和细菌的脂肽,但在各个龄期均不表达，而PH和QH感染后也没有响应；TLR6在QH感染后有所上调表达，但表达量很低；TLR13在雄性成虫表达，PH和QH感染后均上调，但表达量低。

推测TLR在蝙蝠蛾体内对抵抗真菌的感染有一定的作用。

Pellion（PLL）基因能泛素化pelle，对Toll信号途径有正调控的作用。

在蝙蝠蛾发育的各个龄期有一定的表达，在PH和QH感染后，表达量大量上调，推测pellion能通过正调控Toll通道对抵抗真菌起着一定的作用。

综上所述，蝙蝠蛾Toll信号通路在抵抗真菌、细菌的感染过程中起着重要作用，而且可能通过不同的基因拷贝来抵抗烈性真菌和温和真菌。

上图为蝙蝠蛾与其他昆虫toll信号途径比较，其中虚线表示蝙蝠蛾中不存在的基因，而红色字体表示蝙蝠蛾扩张基因，红色填充为蝙蝠蛾在PH或QH感染后上调表达的基因

2.8.3.IMD信号通路

IMD途径主要介导革兰氏阴性菌的先天性免疫反应，导致部分抗菌肽（AMPs）的转录。

该途径主要有8个主要成员，PGRP-LC受体、有丝分裂原激活蛋白激酶TAK1和TAB2[5]、凋亡抑制蛋白DIAP2[6,7]、组成IKK复合体的ird5和Kenny[8]、dFADD受体[9]、Dredd[10]蛋白酶以及转录因子Relish[11]。

该途径通过激活Relish转录因子调控抗菌肽基因的表达。

革兰氏阴性菌和一些革兰氏阳性细菌,如杆状阳性细菌,能结合跨膜蛋白PGRP-LC，通过胞内结构域激活Imd，使其活化成信号分子[12]。

在通过转录生长因子激酶1（TAKI）传递给ird5和kenny复合物，最后导致NF-κB同源物Relish被IKK复合物磷酸化或被Dredd与致死结构域蛋白FADD形成的复合物水解而激活。

Relish通过IKK复合体的磷酸化作用而活化,裂解Relish同源区和锚锭蛋白重复序列,使Relish蛋白进入核仁激活抗微生物肽基因转录,激活抗微生物肽基因表达。

蝙蝠蛾中，PGRP-LB和IMDH属于扩张基因家族

PGRP-L是长链PGRP，文献报道，主要介导革兰氏阴性细菌的识别。

PGRP-LB是蝙蝠蛾扩张基因，共5个拷贝。

进化分析显示，

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