法庭科学DNA实验室检验综合规范.docx

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法庭科学DNA实验室检验综合规范

法庭科学DNA实验室检查规范【GA-T383-】

1范畴      　　

本原则规定了法庭科学DNA实验室检查应遵守基本规定。

本原则合用于所有从事法庭科学检查DNA实验室。

2定义      　　

本原则采用下列定义。

2.1前期检查priorexamination      　　

DNA检查迈进行预实验和确证明验。

     　　2.2有机溶剂法organicextractionofDNA      　　

通过酚－氯仿混合物萃取DNA溶液中蛋白质类有机物质，而保存DNA于水相溶液中提取办法。

2.3Chelex法ChelexextractionofDNA      　　

运用Chelex能有效地去除非核酸有机物性能而提取DNA办法。

2.4硅珠法siliconbeadtest      　　

在硫氰酸胍条件下，运用二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子性能提取DNA办法。

2.5CTAB法cetyltrimethylammoniumbromidemethod      　　

运用非离子型去污剂十六烷基三甲基溴化胺      

（CTAB）具备破坏植物细胞壁和细胞膜及硬组织，并能与DNA形成复合物能力，通过抽提使DNA与蛋白质及多糖类物质有效分离而达到提取高纯度DNA目。

2.6聚合酶链反映polymerasechainreaction-PCR      　　

一种酶促特定DNA片段扩增过程。

3案件受理      　　      　　

3.1刑事案件送检人员需提供公、检、法、司，以及保卫部门盖有公章鉴定委托书或公函，并出示本人工作证。

民事案件送检人员需提供委托单位或个人委托书，并出示本人身份证明。

3.2送检人员需填写送检登记表，详细填写送检单位、送检人姓名、送检日期、简要案情、送检检材名称及特性、有无作过鉴定、原鉴定单位及原鉴定结论、鉴定规定等。

3.3接案人员在理解案情和鉴定规定后，逐个确认检材，并对检材进行编号，有条件照相固定，最后在送检登记表上签名。

3.4检查人员从接案人员手中受理检材时,应详细理解案情和鉴定规定,逐个核对检材后,在送检登记表上签名。

4检材提取和保存      　　

4.1适合DNA鉴定检材涉及血液（痕）、精液（斑）、唾液（斑）、毛发、组织、骨骼等生物检材。

4.2提取检材前注意记录检材大小、形态等特性，必要时照相、录像固定。

提取检材时必要戴手套。

提取检材必要分别包装，在包装袋上注明检材名称、来源、数量、采集日期等，并有采集人及采集见证人签名。

4.3对于活体检材，普通用医用消毒纱布或中速滤纸采集指血或耳垂血（2cm2以上），自然晾干。

可以用口腔拭子提取口腔粘膜细胞，提取前须清水漱口，检材自然晾干；或取毛发3根~5根。

以上检材均用纸袋包装后常温保存。

4.4对于血痕，类似衣裤、地毯、床单上血痕，可以剪下一某些纸袋包装后常温保存；类似衣柜、墙壁、地面、刀、斧上血迹可以刮取，或用生理盐水浸湿纱线提取，自然晾干后纸袋包装常温保存。

4.5涉嫌性侵害，应用棉签分别提取阴道外端、中部和后穹窿部，必要时还应注意会阴、下腹、口腔、肛门等部位有无精液（斑），以及现场怀疑有精斑其她检材，如床单、被褥、卫生纸、避孕套、内裤、衣物等。

所有检材应当分别提取、标明记号、自然晾干、纸袋包装后常温保存。

4.6现场可疑毛发用镊子提取，用纸折叠后置纸袋内常温保存。

4.7具有唾液斑检材如烟头、果核、香口胶等用镊子提取，纸袋包装后常温保存。

4.8人流刮宫组织，取5g以上确以为绒毛组织；引产胎儿，取5g以上组织；羊水，取2ml以上液体。

提取检材干净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。

4.9新鲜尸体，可用医用消毒纱布或中速滤纸提取血液（3cm2以上），自然晾干，纸袋包装后常温保存。

新鲜尸体也可取肌肉组织（50g以上）；

腐败尸体，尽量提取相对新鲜组织，涉及指甲（2枚以上）、肋软骨（5cm以上）或者其他软骨（5g以上）、深部肌肉组织（50g以上）、毛发（10根以上）；白骨化尸体尽量提取指甲、长骨、牙齿、毛发。

以上检材干净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。

4.10依照案件状况，注意提取对照样本。

5前期检查      　　

5.1血痕检查      　　

5.1.1预实验—联苯胺实验      　　

5.1.1.1试剂      　　

a）联苯胺无水乙醇饱和液；      　　

b）3%过氧化氢溶液；      　　

c）冰醋酸。

5.1.1.2办法      　　

取滤纸轻轻擦拭斑迹，分别加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液、3%过氧化氢溶液，及时浮现翠蓝色为阳性反映。

5.1.2种属实验—环状沉淀实验      　　

5.1.2.1试剂      　　

a）抗人血红蛋白血清或抗人血清；      　　

b）生理盐水。

5.1.2.2办法      　　

取少量血痕检材，滴入适量生理盐水制成浸出液。

取试管加入抗人血红蛋白血清或抗人血清，然后小心加入上述浸出液，60min内两液界面间浮现白色沉淀环者为阳性。

5.1.3种属实验—对流免疫电泳法      　　

5.1.3.1试剂      　　

a）巴比妥缓冲液；      　　

b）高电渗琼脂糖；      　　

c）抗人血红蛋白血清或抗人血清；      　　

d）双蒸馏水。

5.1.3.2办法      　　

取高电渗琼脂糖和巴比妥缓冲液制成琼脂溶液，取琼脂溶液平铺于载玻片上，凝固后打两排成对孔。

取少量血痕检材，滴入适量双蒸馏水或巴比妥缓冲液制成浸出液，加入上述琼脂板负极侧孔内，在琼脂板正极侧孔内加入抗人血红蛋白血清或抗人血清，电泳30min～40min。

电泳完毕后在黑色背景上方，通过斜光照射，观测两孔间形成抗原－抗体复合物白色沉淀线，有白色沉淀线者为阳性。

5.1.4种属实验—金标试纸检查法      　　

试剂和办法以阐明书为准。

5.2精斑检查      　　

5.2.1预实验—酸性磷酸酶实验      　　

5.2.1.1试剂      　　

a）碳酸钙b-萘酯；      　　

b）1-氯化重氮蒽醌；      　　

c）缓冲液：

氯化钠、冰醋酸、醋酸钠。

5.2.1.2办法      　　

取适量碳酸钙b-萘酯和1-氯化重氮蒽醌溶于缓冲液制成检测试剂，取少量可疑斑迹置白瓷板凹内，滴加上述试剂，如检材确为精斑，在30s内即可见橘红色反映。

5.2.2确证明验—精子检出法      　　

5.2.2.1试剂      　　

a）1%酸性复红溶液；      　　

b）1%美蓝溶液；      　　

c）1%盐酸；      　　

d）生理盐水。

5.2.2.2办法      　　

取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后，涂于载玻片上，干燥后分别用1%酸性复红溶液和1%美蓝溶液染色，1%盐酸和清水洗涤，干燥后镜检。

精子头部被染成红色，而尾部被染成蓝色。

5.2.3确证明验—金标试纸检查法      　　

试剂和办法以阐明书为准。

5.3唾液斑检查      　　

5.3.1淀粉酶实验      　　

5.3.1.1试剂      　　

a）0.01%淀粉溶液；      　　

b）碘－碘化钾溶液；      　　

5.2.2.2办法      　　

取少量可疑斑迹加适量0.01%淀粉溶液，37℃温箱30min，加碘－碘化钾溶液，呈淡黄色和无色时为阳性反映，呈蓝色则为阴性。

6DNA提取      　　

6.1有机溶剂法      　　

6.1.1器材和试剂      　　

a）高速离心机；      　　

b）水浴或干浴；

     　　c）移液器

     　　d）细胞溶解缓冲液（CLB）：

蔗糖，MgCl2，Tris-HCl，TritonX-100；

     　　e）蛋白溶解缓冲液（PLB）：

NaCl，EDTA-Na2；

     　　f）DNA提取缓冲液：

Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT；

     　　g）TNE缓冲液：

Tris-HCl、EDTA、NaCl；

     　　h）TE缓冲液：

Tris-HCl、EDTA；

     　　i）5×精子提取液：

Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT；

     　　j）纯化试剂；

     　　k）CentriconTM-100；

     　　l）SDS；

     　　m）DTT；

     　　n）饱和酚和氯仿；

     　　o）无水乙醇和70%乙醇溶液；

     　　p）NaCl或NaAc；

     　　q）蛋白酶K。

     　　6.1.2办法

     　　6.1.2.1血液

     　　a）取适量血液加入等体积细胞溶解缓冲液，混匀至透明；

     　　b）离心后去上清液，沉淀中加入蛋白溶解缓冲液匀浆；

     　　c）加入SDS和蛋白酶K，37℃消化4h以上；

     　　d） 加入等体积酚、酚和氯仿（1:

1混合）、氯仿各提取一次后，加1/10体积NaCl或NaAc溶液和2.5倍体积冷无水乙醇混匀，得到团状DNA沉淀；

     　　e）离心去上清液，沉淀中加入70%乙醇混匀；

     　　f）离心去上清液，晾干后加入TE缓冲液备用。

     　　6.1.2.2混合斑

     　　a）剪碎带有精子检材，加入适量TNE缓冲液，37℃保温0.5h～1h，加入SDS和蛋白酶K，37℃保温1h～2h消化女性上皮细胞；

 b）底部带孔离心管离心分拜别除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE洗涤离心多次；

     　　c）沉淀物内加入5×精子提取液、蛋白酶K，置37℃消化3h～4h；

     　　d）如下同6.1.2.1d）、e）、f）。

6.1.2.3组织

     　　a）取少量组织（脑、肌肉等）加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆；

     　　b）加入SDS和蛋白酶K，37℃消化4h～6h。

     　　c）如下同6.1.2.1d）、e）、f）。

     　　6.1.2.4毛干

     　　a）将毛干剪成3mm～5mm长，无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加入DTT、SDS、蛋白酶K、蛋白溶解缓冲液，37℃消化至完全溶解；

      b）加入等体积酚、酚∶氯仿（1∶1混合）、氯仿各抽提一次，加入1/10体积NaCl或NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混合后-20℃冷冻1h以上；

     　　c）离心去上清液，沉淀中加入70%乙醇混匀；

     　　d）离心去上清液，晾干后加入TE缓冲液备用。

     　　6.1.2.5骨和牙齿

     　　a）以手术刀刮净骨骼和牙齿表面垢物，用温热蒸馏水冲洗两次，紫外光照射1h。

再用锤子将牙齿砸成粉末和用电钻取出骨松质，并将其用研磨器进一步磨碎；

     　　b）取适量骨或牙齿粉末，加入DNA提取缓冲液、蛋白酶K，于37℃消化过夜；

     　　c）酚和氯仿提取，提取液置CentriconTM-100中离心浓缩后，加1/10体积NaCl和2.5倍无水乙醇-20℃冰箱过夜；

     　　d）离心去上清液，晾干加入TE缓冲液溶解后纯化，纯化试剂和办法以阐明书为准。

     　　6.2Chelex法

     　　6.2.1器材和试剂

     　　a）高速离心机；

     　　b）水浴或干浴；

     　　c）移液器；

     　　d）Chelex-100溶液；

     　　e）TNE缓冲液

     　　f）蛋白酶K溶液；

     　　g）SDS；

     　　h）DTT溶液；

     　　i）双蒸馏水。

     　　6.2.2办法

     　　6.2.2.1血液和血痕

     　　a）取少量血液或血痕加入适量双蒸馏水，室温30min；

     　　b）离心后去上清液，沉淀中加入Chelex-100，56℃消化30min；

     　　c）煮沸8min，离心后4℃冰箱内备用。

     　　6.2.2.2混合斑

     　　a）剪碎带有精子检材，加入适量TNE缓冲液，37℃保温0.5h～1h，加入SDS和蛋白酶K，37℃保温1h～2h消化女性上皮细胞；

     　　b）底部带孔离心管离心分拜别除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE离心洗涤多次；

     　　c）沉淀物内加入Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT溶液，置56℃消化1h～2h；

     　　d）煮沸8min，离心后4℃冰箱内备用。

     　　6.2.2.3组织

     　　a）取少量组织（脑、肌肉等）加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆；

     　　b）加入Chelex-100、蛋白酶K，56℃消化2h～3h；

     　　c）煮沸8min，离心后4℃冰箱内备用。

     　　6.2.2.4唾液斑

     　　a）信封和邮票用灭菌双蒸水润湿棉签涂抹信封封口处和邮票背面，烟蒂直接剪取外层纸，剪碎后加入Chelex-100、蛋白酶K溶液，56℃消化1.5h；

     　　b）煮沸8min，离心后4℃冰箱内备用。

     　　6.2.2.5毛发

     　　a）毛根剪取毛发毛根某些5mm～10mm，毛干则剪成3mm～5mm长，无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加入

     Chelex-100、蛋白酶K、DTT溶液，56℃消化至完全溶解；

     　　b）煮沸8min，离心后4℃冰箱内备用。

     　　6.2.2.6骨和牙齿

     　　a）研碎牙髓或骨髓，加入Chelex-100、蛋白酶K溶液，56℃消化过夜；

     　　b）煮沸8min，离心后4℃冰箱内备用。

     　　6.3硅珠法

     　　6.3.1器材和试剂

     　　a）高速离心机；

     　　b）水浴或干浴；

     　　c）移液器；

     　　d）吸附液：

硫氰酸胍、Tris-HCl、EDTA、TritonX-100；

     　　e）漂洗液：

硫氰酸胍、Tris-HCl；

     　　f）硅珠悬液：

二氧化硅；

     　　g）TES缓冲液：

Tris、NaCl、EDTA；

     　　h）十二烷基肌氨酸钠；

     　　i）SDS；

     　　j）DTT；

     　　k）蛋白酶K；

     　　l）无水乙醇和70%乙醇；

     　　m）双蒸馏水。

     　　6.3.2办法

     　　6.3.2.1血液和血痕

     　　a）取适量血液和血痕，加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠，煮沸5min以上，血痕离心去载体；

     　　b）加入吸附液，混和后加入硅珠悬液，混和后室温15min左右；

     　　c）离心去上清液，加入漂洗液，混和；

     　　d）离心去上清液，加入冷70%乙醇，混和；

     　　e）离心去上清液，加入TES，56℃保温10min以上；

     　　f）离心后4℃冰箱内备用。

     　　6.3.2.2混合斑

     　　a）剪碎带有精子检材，加入适量TES缓冲液、SDS和蛋白酶K溶液,37℃消化1h～2h；

     　　b）去载体，离心去上清液，TES缓冲液洗涤沉淀物多次；

     　　c）加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠，煮沸5min以上；

     　　d）离心后上清液按6.3.2.1b）、c）、d）、e）、f）操作进行。

     　　6.3.2.3毛发和指（趾）甲

     　　a）毛发或指（趾）甲分别用双蒸馏水和无水乙醇洗涤，剪碎后加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和DTT溶液，56℃消化至完全溶解；

     　　b）离心后上清液按6.3.2.1b）、c）、d）、e）、f）操作进行。

     　　6.3.2.4骨和牙齿

     　　a）取适量骨或牙齿粉末（见有机溶剂提取法）

     　　分别用TES缓冲液和EDTA洗涤，加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和蛋白酶K、DTT溶液，56℃消化过夜；

     　　b）离心后上清液按6.3.2.1b）、c）、d）、e）、f）操作进行。

     　　6.4CTAB法

     　　6.4.1器材和试剂

     　　a）高速离心机；

     　　b）水浴或干浴；

     　　c）移液器；

     　　d）CTAB提取缓冲液：

CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）、Tris-HCl、EDTA、NaCl、巯基乙醇；

     　　e）氯仿/异戊醇（24：

1）；

     　　f）纯化试剂盒；

     　　g）蛋白酶K；

     　　h）SDS；

     　　i）DTT；

     　　j）双蒸馏水。

     　　6.4.2办法

     　　6.4.2.1骨和牙齿

     　　a）取适量骨或牙齿粉末（见有机溶剂提取法），加入CTAB提取缓冲液，室温过夜；

     　　b）65℃保温1h，离心后保存上清液，加入等体积氯仿/异戊醇，离心后保存上清液；

     　　c）上清液加入MicroconTM-100中，离心浓缩；

     　　d）浓缩液进行纯化，纯化试剂和办法以阐明书为准。

     　　6.5PCR缓冲液解决法

     　　6.5.1器材和试剂

     　　a）高速离心机；

     　　b）水浴或干浴；

     　　c）移液器；

     　　d）10×PCR反映缓冲液；

     　　e）蛋白酶K；

     　　f）DTT；

     　　g）无水乙醇；

     　　6.5.2办法

     　　6.5.2.1毛干

     　　a）将毛干剪成3mm～5mm长，用无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干。

     　　b）加10×PCR反映缓冲液、DTT、蛋白酶K溶液，混匀后56℃消化至完全溶解；

     　　c）煮沸变性，离心后4℃冰箱内备用。

7DNA质和量检测

     　　7.1紫外分光光度计法

     　　7.1.1原理

     　　通过测定DNA溶液对光吸取，拟定核酸含量和核酸纯度，不能区别DNA和RNA含量。

7.1.2办法

     　　a）预置分光光度计零点；

     　　b）充分混匀样品，读取260nm和280nmOD值；

     　　c）计算A260/A280比率，比率>1.6为得到较纯DNA；

     　　d）计算DNA浓度：

     　　单链DNA：

1OD=40μg/ml；

     　　双链DNA：

1OD=50μg/ml；

     　　DNA浓度（μg/ml）=稀释倍数×A260×40μg/ml÷1000μg。

     　　7.2定量胶检测法

     　　7.2.1原理

     　　荧光染料溴乙锭可嵌入DNA分子碱基平面之间，在紫外线照射下发出荧光，其光强度与DNA含量成正比。

比较同一凝胶中待测DNA样品与系列原则DNA荧光强度，拟定DNA含量。

     　　7.2.2试剂

     　　a）10′载样缓冲液：

溴酚篮、二甲基晴篮、聚蔗糖；

     　　b）50′TAE缓冲液：

Tris、乙酸钠、EDTA；

     　　c）溴乙锭；

     　　d）DNA原则液，依照详细需要选用。

     　　7.2.3办法

     　　a）配制琼脂糖凝胶；

     　　b）电泳；

     　　c）染色；

     　　d）紫外灯下观测。

     　　7.3人类DNA定量试剂盒

     　　试剂和办法以阐明书为准。

     　　7.4定量PCR仪

     　　试剂和办法以阐明书为准。

     　　8PCR反映

     　　8.1基因座

     　　建议在如下范畴内选取：

     　　D1S80、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、CSF1PO、TPOX、TH01、vWA、FGA、Penta

     E、PentaD、F13A01、FESFPS、Amelogenin。

     　　8.2试剂

     　　a）建议选用国际通用试剂盒；

     　　b）自行开发试剂体系须经有关专家委员会承认后方可使用于寻常检案。

     　　8.3仪器

     　　PCR扩增仪。

     　　8.4扩增反映体系及循环参数

     　　以各阐明书为准。

     　　9反映产物检测

     　　9.1银染检测

     　　9.1.1器材和试剂

     　　a）电泳仪器及制备凝胶板套具；

     　　b）移液器；

     　　c）尿素；

     　　d）40%Acr：

bis（19：

1）；

     　　e）TEMED；