法庭科学DNA实验室检验综合规范.docx

1、法庭科学DNA实验室检验综合规范法庭科学DNA实验室检查规范【GA-T383-】1 范畴 本原则规定了法庭科学DNA实验室检查应遵守基本规定。 本原则合用于所有从事法庭科学检查DNA实验室。 2 定义 本原则采用下列定义。 2.1 前期检查 prior examination DNA检查迈进行预实验和确证明验。 2.2 有机溶剂法 organic extraction of DNA 通过酚氯仿混合物萃取DNA溶液中蛋白质类有机物质，而保存DNA于水相溶液中提取办法。 2.3 Chelex法 Chelex extraction of DNA 运用Chelex能有效地去除非核酸有机物性能而提取DN

2、A办法。 2.4 硅珠法 silicon bead test 在硫氰酸胍条件下，运用二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子性能提取DNA办法。 2.5 CTAB法 cetyltrimethylammonium bromide method 运用非离子型去污剂十六烷基三甲基溴化胺 (CTAB)具备破坏植物细胞壁和细胞膜及硬组织，并能与DNA形成复合物能力，通过抽提使DNA与蛋白质及多糖类物质有效分离而达到提取高纯度DNA目。 2.6 聚合酶链反映 polymerase chain reaction-PCR 一种酶促特定DNA片段扩增过程。 3 案件受理 3.1刑事案件送检人员需提供公、检、法

3、、司，以及保卫部门盖有公章鉴定委托书或公函，并出示本人工作证。民事案件送检人员需提供委托单位或个人委托书，并出示本人身份证明。 3.2 送检人员需填写送检登记表，详细填写送检单位、送检人姓名、送检日期、简要案情、送检检材名称及特性、有无作过鉴定、原鉴定单位及原鉴定结论、鉴定规定等。 3.3 接案人员在理解案情和鉴定规定后，逐个确认检材，并对检材进行编号，有条件照相固定，最后在送检登记表上签名。 3.4 检查人员从接案人员手中受理检材时,应详细理解案情和鉴定规定,逐个核对检材后,在送检登记表上签名。 4 检材提取和保存 4.1 适合DNA鉴定检材涉及血液（痕）、精液（斑）、唾液（斑）、毛发、组织

4、、骨骼等生物检材。 4.2提取检材前注意记录检材大小、形态等特性，必要时照相、录像固定。提取检材时必要戴手套。提取检材必要分别包装，在包装袋上注明检材名称、来源、数量、采集日期等，并有采集人及采集见证人签名。 4.3 对于活体检材，普通用医用消毒纱布或中速滤纸采集指血或耳垂血（2cm2以上），自然晾干。可以用口腔拭子提取口腔粘膜细胞，提取前须清水漱口，检材自然晾干；或取毛发3根5根。以上检材均用纸袋包装后常温保存。 4.4对于血痕，类似衣裤、地毯、床单上血痕，可以剪下一某些纸袋包装后常温保存；类似衣柜、墙壁、地面、刀、斧上血迹可以刮取，或用生理盐水浸湿纱线提取，自然晾干后纸袋包装常温保存。 4

5、.5 涉嫌性侵害，应用棉签分别提取阴道外端、中部和后穹窿部，必要时还应注意会阴、下腹、口腔、肛门等部位有无精液（斑），以及现场怀疑有精斑其她检材，如床单、被褥、卫生纸、避孕套、内裤、衣物等。所有检材应当分别提取、标明记号、自然晾干、纸袋包装后常温保存。 4.6 现场可疑毛发用镊子提取，用纸折叠后置纸袋内常温保存。 4.7 具有唾液斑检材如烟头、果核、香口胶等用镊子提取，纸袋包装后常温保存。 4.8人流刮宫组织，取5g以上确以为绒毛组织；引产胎儿，取5g以上组织；羊水，取2ml以上液体。提取检材干净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。 4.9 新鲜尸体，可用医用消毒纱布或中速滤纸提取血液（3cm2以上

6、），自然晾干，纸袋包装后常温保存。新鲜尸体也可取肌肉组织（50g以上）；腐败尸体，尽量提取相对新鲜组织，涉及指甲（2枚以上）、肋软骨（5cm以上）或者其他软骨（5g以上）、深部肌肉组织（50g以上）、毛发（10根以上）；白骨化尸体尽量提取指甲、长骨、牙齿、毛发。以上检材干净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。 4.10 依照案件状况，注意提取对照样本。 5 前期检查 5.1 血痕检查 5.1.1 预实验联苯胺实验 5.1.1.1 试剂 a） 联苯胺无水乙醇饱和液； b） 3%过氧化氢溶液； c） 冰醋酸。 5.1.1.2 办法 取滤纸轻轻擦拭斑迹，分别加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液、3%过氧化氢溶液

7、，及时浮现翠蓝色为阳性反映。 5.1.2 种属实验环状沉淀实验 5.1.2.1 试剂 a） 抗人血红蛋白血清或抗人血清； b） 生理盐水。 5.1.2.2 办法 取少量血痕检材，滴入适量生理盐水制成浸出液。取试管加入抗人血红蛋白血清或抗人血清，然后小心加入上述浸出液，60min内两液界面间浮现白色沉淀环者为阳性。 5.1.3 种属实验对流免疫电泳法 5.1.3.1 试剂 a） 巴比妥缓冲液； b） 高电渗琼脂糖； c） 抗人血红蛋白血清或抗人血清； d） 双蒸馏水。 5.1.3.2 办法 取高电渗琼脂糖和巴比妥缓冲液制成琼脂溶液，取琼脂溶液平铺于载玻片上，凝固后打两排成对孔。取少量血痕检材，滴

8、入适量双蒸馏水或巴比妥缓冲液制成浸出液，加入上述琼脂板负极侧孔内，在琼脂板正极侧孔内加入抗人血红蛋白血清或抗人血清，电泳30min40min。电泳完毕后在黑色背景上方，通过斜光照射，观测两孔间形成抗原抗体复合物白色沉淀线，有白色沉淀线者为阳性。 5.1.4 种属实验金标试纸检查法 试剂和办法以阐明书为准。 5.2 精斑检查 5.2.1 预实验酸性磷酸酶实验 5.2.1.1 试剂 a） 碳酸钙b-萘酯； b） 1-氯化重氮蒽醌； c） 缓冲液：氯化钠 、冰醋酸、醋酸钠。 5.2.1.2 办法 取适量碳酸钙b-萘酯和1-氯化重氮蒽醌溶于缓冲液制成检测试剂，取少量可疑斑迹置白瓷板凹内，滴加上述试剂，

9、如检材确为精斑，在30s内即可见橘红色反映。 5.2.2 确证明验精子检出法 5.2.2.1 试剂 a） 1%酸性复红溶液； b） 1%美蓝溶液； c） 1%盐酸； d） 生理盐水。 5.2.2.2 办法 取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后，涂于载玻片上，干燥后分别用1%酸性复红溶液和1%美蓝溶液染色，1%盐酸和清水洗涤，干燥后镜检。精子头部被染成红色，而尾部被染成蓝色。 5.2.3 确证明验金标试纸检查法 试剂和办法以阐明书为准。 5.3 唾液斑检查 5.3.1 淀粉酶实验 5.3.1.1 试剂 a） 0.01%淀粉溶液； b） 碘碘化钾溶液； 5.2.2.2 办法 取少量可疑斑迹加适量0.

10、01%淀粉溶液，37温箱30min，加碘碘化钾溶液，呈淡黄色和无色时为阳性反映，呈蓝色则为阴性。 6 DNA提取 6.1 有机溶剂法 6.1.1 器材和试剂 a） 高速离心机； b） 水浴或干浴； c） 移液器 d） 细胞溶解缓冲液（CLB）：蔗糖，MgCl2，Tris-HCl，TritonX-100； e） 蛋白溶解缓冲液（PLB）：NaCl，EDTA-Na2； f） DNA提取缓冲液：Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT； g） TNE 缓冲液：Tris-HCl、EDTA、NaCl； h） TE缓冲液：Tris-HCl、EDTA； i） 5精子提取液：Tris-HCl、ED

11、TA、NaCl、SDS、DTT； j） 纯化试剂； k） CentriconTM-100； l） SDS； m） DTT； n） 饱和酚和氯仿； o） 无水乙醇和70%乙醇溶液； p） NaCl或NaAc； q） 蛋白酶K。 6.1.2 办法 6.1.2.1 血液 a） 取适量血液加入等体积细胞溶解缓冲液，混匀至透明； b） 离心后去上清液，沉淀中加入蛋白溶解缓冲液匀浆； c） 加入SDS和蛋白酶K，37消化4h以上； d） 加入等体积酚、酚和氯仿(1:1混合)、氯仿各提取一次后，加1/10体积NaCl或NaAc溶液和2.5倍体积冷无水乙醇混匀，得到团状DNA沉淀； e） 离心去上清液，沉淀中

12、加入70%乙醇混匀； f） 离心去上清液，晾干后加入TE缓冲液备用。 6.1.2.2 混合斑 a） 剪碎带有精子检材，加入适量TNE 缓冲液， 37保温0.5h1h，加入SDS和蛋白酶K， 37保温1h2h消化女性上皮细胞； b） 底部带孔离心管离心分拜别除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE洗涤离心多次； c） 沉淀物内加入5精子提取液、蛋白酶K，置37消化3h4h； d） 如下同6.1.2.1d）、e）、f）。6.1.2.3 组织 a） 取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆； b） 加入SDS和蛋白酶K， 37消化4h6h。 c） 如下同6.1.2.1d）、e）、f）。 6

13、.1.2.4 毛干 a） 将毛干剪成3mm5mm长，无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加入DTT、SDS、蛋白酶K、蛋白溶解缓冲液， 37消化至完全溶解； b） 加入等体积酚、酚氯仿（11混合）、氯仿各抽提一次，加入 1/10体积 NaCl或NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混合后-20冷冻 1h以上； c） 离心去上清液，沉淀中加入70%乙醇混匀； d） 离心去上清液，晾干后加入TE缓冲液备用。 6.1.2.5 骨和牙齿 a） 以手术刀刮净骨骼和牙齿表面垢物，用温热蒸馏水冲洗两次，紫外光照射1h。再用锤子将牙齿砸成粉末和用电钻取出骨松质，并将其用研磨器进一步磨碎； b） 取适量骨或牙齿粉

14、末，加入DNA提取缓冲液、蛋白酶K，于37消化过夜； c） 酚和氯仿提取，提取液置CentriconTM -100中离心浓缩后，加1/10体积NaCl和2.5倍无水乙醇-20冰箱过夜； d） 离心去上清液，晾干加入TE缓冲液溶解后纯化，纯化试剂和办法以阐明书为准。 6.2 Chelex法 6.2.1 器材和试剂 a） 高速离心机； b） 水浴或干浴； c） 移液器； d） Chelex-100溶液； e） TNE 缓冲液 f） 蛋白酶K溶液； g） SDS； h） DTT溶液； i） 双蒸馏水。 6.2.2 办法 6.2.2.1 血液和血痕 a） 取少量血液或血痕加入适量双蒸馏水，室温30mi

15、n； b） 离心后去上清液，沉淀中加入Chelex-100，56消化 30min； c） 煮沸8min，离心后4冰箱内备用。 6.2.2.2 混合斑 a） 剪碎带有精子检材，加入适量TNE 缓冲液， 37保温0.5h1h，加入SDS和蛋白酶K， 37保温1h2h消化女性上皮细胞； b） 底部带孔离心管离心分拜别除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE离心洗涤多次； c） 沉淀物内加入Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT溶液，置56消化1h2h； d）煮沸8min，离心后4冰箱内备用。 6.2.2.3 组织 a） 取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆； b） 加入Chelex

16、-100 、蛋白酶K，56消化 2h3h； c） 煮沸8min，离心后4冰箱内备用。 6.2.2.4 唾液斑 a） 信封和邮票用灭菌双蒸水润湿棉签涂抹信封封口处和邮票背面，烟蒂直接剪取外层纸，剪碎后加入Chelex-100、蛋白酶K溶液，56消化1.5h； b） 煮沸8min，离心后4冰箱内备用。 6.2.2.5 毛发 a） 毛根剪取毛发毛根某些5mm10mm，毛干则剪成3mm5mm长，无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加入 Chelex-100、蛋白酶K、DTT溶液， 56消化至完全溶解； b） 煮沸8min，离心后4冰箱内备用。 6.2.2.6 骨和牙齿 a） 研碎牙髓或骨髓，加入C

17、helex-100、蛋白酶K溶液，56消化过夜； b） 煮沸8min，离心后4冰箱内备用。 6.3 硅珠法 6.3.1 器材和试剂 a） 高速离心机； b） 水浴或干浴； c） 移液器； d） 吸附液：硫氰酸胍、Tris-HCl、EDTA、Triton X-100； e） 漂洗液：硫氰酸胍、Tris-HCl； f） 硅珠悬液：二氧化硅； g） TES缓冲液：Tris、NaCl、EDTA； h） 十二烷基肌氨酸钠； i） SDS； j） DTT； k） 蛋白酶K； l） 无水乙醇和70%乙醇； m） 双蒸馏水。 6.3.2 办法 6.3.2.1 血液和血痕 a） 取适量血液和血痕，加入TES缓冲

18、液和十二烷基肌氨酸钠，煮沸5min以上，血痕离心去载体； b） 加入吸附液，混和后加入硅珠悬液，混和后室温15min左右； c） 离心去上清液，加入漂洗液，混和； d） 离心去上清液，加入冷70%乙醇，混和； e） 离心去上清液，加入TES，56保温10min以上； f） 离心后4冰箱内备用。 6.3.2.2 混合斑 a） 剪碎带有精子检材，加入适量TES缓冲液、SDS和蛋白酶K溶液,37消化1h2h； b） 去载体，离心去上清液，TES缓冲液洗涤沉淀物多次； c） 加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠，煮沸5min以上； d） 离心后上清液按6.3.2.1 b）、c)、d)、e）、f)操作进行

19、。 6.3.2.3 毛发和指（趾）甲 a） 毛发或指（趾）甲分别用双蒸馏水和无水乙醇洗涤，剪碎后加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和DTT溶液，56消化至完全溶解； b） 离心后上清液按6.3.2.1 b）、c)、d)、e）、f)操作进行。 6.3.2.4 骨和牙齿 a） 取适量骨或牙齿粉末（见有机溶剂提取法） 分别用TES缓冲液和EDTA洗涤，加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和蛋白酶K、DTT溶液，56消化过夜； b） 离心后上清液按6.3.2.1 b）、c)、d)、e）、f)操作进行。 6.4 CTAB法 6.4.1 器材和试剂 a） 高速离心机； b） 水浴或干浴； c） 移液器； d

20、） CTAB提取缓冲液：CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）、Tris-HCl、EDTA、NaCl、巯基乙醇； e） 氯仿/异戊醇 (24：1)； f） 纯化试剂盒； g） 蛋白酶K； h） SDS； i） DTT； j） 双蒸馏水。 6.4.2 办法 6.4.2.1 骨和牙齿 a） 取适量骨或牙齿粉末（见有机溶剂提取法），加入CTAB提取缓冲液，室温过夜； b） 65保温1h，离心后保存上清液，加入等体积氯仿/异戊醇 ，离心后保存上清液； c） 上清液加入MicroconTM -100中，离心浓缩； d） 浓缩液进行纯化，纯化试剂和办法以阐明书为准。 6.5 PCR缓冲液解决法 6.5.1 器材

21、和试剂 a） 高速离心机； b） 水浴或干浴； c） 移液器； d） 10PCR反映缓冲液； e） 蛋白酶K； f） DTT； g） 无水乙醇； 6.5.2 办法 6.5.2.1 毛干 a） 将毛干剪成3mm5mm长，用无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干。 b） 加10PCR反映缓冲液、DTT、蛋白酶K溶液，混匀后56消化至完全溶解； c） 煮沸变性，离心后4冰箱内备用。 7 DNA质和量检测 7.1 紫外分光光度计法 7.1.1 原理 通过测定DNA溶液对光吸取，拟定核酸含量和核酸纯度，不能区别DNA和RNA含量。7.1.2 办法 a） 预置分光光度计零点； b） 充分混匀样品，读取26

22、0nm和280nmOD值； c） 计算A260/A280比率，比率1.6为得到较纯DNA； d） 计算DNA浓度： 单链DNA：1 OD = 40g/ml； 双链DNA：1 OD = 50g/ml； DNA浓度(g/ml) = 稀释倍数 A26040 g/ml 1000g。 7.2 定量胶检测法 7.2.1 原理 荧光染料溴乙锭可嵌入DNA分子碱基平面之间，在紫外线照射下发出荧光，其光强度与DNA含量成正比。比较同一凝胶中待测DNA样品与系列原则DNA荧光强度，拟定DNA含量。 7.2.2 试剂 a） 10载样缓冲液：溴酚篮、二甲基晴篮、聚蔗糖； b） 50TAE缓冲液：Tris、乙酸钠、ED

23、TA； c） 溴乙锭； d） DNA原则液，依照详细需要选用。 7.2.3 办法 a） 配制琼脂糖凝胶； b） 电泳； c） 染色； d） 紫外灯下观测。 7.3 人类DNA定量试剂盒 试剂和办法以阐明书为准。 7.4 定量PCR仪 试剂和办法以阐明书为准。 8 PCR反映 8.1 基因座 建议在如下范畴内选取： D1S80、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、CSF1PO、TPOX、TH01、vWA、FGA、Penta E、Penta D、F13A01、FESFPS、Amelogenin。 8.2 试剂 a） 建议选用国际通用试剂盒； b） 自行开发试剂体系须经有关专家委员会承认后方可使用于寻常检案。 8.3 仪器 PCR扩增仪。 8.4 扩增反映体系及循环参数 以各阐明书为准。 9 反映产物检测 9.1 银染检测 9.1.1 器材和试剂 a) 电泳仪器及制备凝胶板套具； b） 移液器； c） 尿素； d） 40% Acr：bis (19：1)； e） TEMED；