吸光度标准曲线绘制.docx

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吸光度标准曲线绘制

吸光度标准曲线绘制

采集样本：

广西医科大学口腔医学xx级13班四个组中7组生物化学实验数据采集时间：

xx年11月15日xx~xx上学期第十一周周一下午采集人：

何洁梅

一、几组ALT与其吸光度的标准曲线数据记录

ALT活力单位A520吴修团1组A520黎丁菱1组A520杨璇璇1组A520谢晓兰2组A520莫雪玲2组A520李文良3组A520文全海4组

00000000

280.1180.1320.2090.0520.0660.0790.032

570.3160.2070.2560.1010.1420.1880.144

970.2860.2570.2940.2180.2180.310.185

1500.3640.2830.3480.3070.2490.4690.198

2000.4980.3340.4050.3880.390.3650.206

二、各采集样本汇总图

（1）样本1测定得待测血清ALT活力单位为50U/L

（2）样本2测定得待测血清ALT活力单位为

97U/L

（3）样本3测定得待测血清ALT活力单位为

135U/L

（4）样本4测定得待测血清ALT活力单位为

70U/L

（5）样本5测定得待测血清ALT活力单位为

148U/L

（6）样本6测定得待测血清ALT活力单位为

45U/L

（7）样本7测定得待测血清ALT活力单位为

98U/L

四、采集数据处理结果分析

1．数据总结

样本编号测定的ALT活力单位是否大于40U/L正常/非正常

150是非正常

297是非正常

3135是非正常

470是非正常

5148是非正常

645是非正常

798是非正常

平均值92均为“是”均为“非正常”

2.针对数据处理结果的分析

采集的7组数据经标准曲线测量后，得到的ALT活力单位值均大于40，即均为非正常值，综上，认为待测血清中ALT含量超于正常值。

3.针对源数据的分析

采集的7组数据中样本4、5、6的数据经画图后可基本分布呈过原点的线性关系，符合理论规律，但其他的数据误差较大。

另外，比较符合理想标准曲线的4、5、6样本的三个ALT活力单位值也存在较大的出入。

4.经分析，总结可能的误差如下

（1）配置丙酮酸标准溶液、底物溶液、磷酸缓冲液的混合溶液时，丙酮酸标准溶液的剂量都很小（如0.05ml0.10ml），容易造成误差。

（2）加入2,4—二硝基苯肼的时间可能有误差，保温的时间，以及加入NaOH以停止反应的时间都有可能有偏差，容易造成较大。

Excel是Microsoftoffices系统的重要组成，它是界于WORD字处理软件与ACCESS数据库软件之间的电子表格工具，功能十分强大，特别适合于日常工作使用。

使用得好，完全比目前所有的检验科办公系统优秀。

现就先介绍一下如何使用Excel绘制标准曲线。

首先，将数据好输入Excel，并选取完成的数据区，并点击图表向导，如下图所示。

点击图表向导后会运行图表向导如下图，先在图表类型中选“XY散点图”，并选了图表类型的“散点图”（第一个没有连线的）。

点击“下一步”，出现如下图界面。

如是输入是如本例横向列表的就不用更改，如果是纵向列表就改选“列”。

如果发现图不理想，就要仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，可以点击“系列”来更改，如下图。

如果是X值错了就点击它文本框右边的小图标，结果如下图：

出现上图后，如图在表上选取正确的数据区域。

然后点击“下一步”出现图表选项界面，如下图，上应调整选项，以满足自己想要的效果。

点击“下一步”，现在一张带标准值的完整散点图就已经完成，如下图。

完成了散点图，现在需要根据数据进行回归分析，计算回归方程，绘制出标准曲线。

其实这很简单，先点击图上的标准值点，然后按右键，点击“添加趋势线”。

如下图。

由于本例是线性关系，在类型中选“线性”如下图

点击“确定”，标准曲线就回归并画好了。

标准曲线是画好了，可是我们怎么知道回归后的方程是什么样呢？

这了简单，点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然后按右键，选趋势线格式，如下图：

在显示公式和显示R平方值（直线相关系数）前点一下，勾上。

再点确定。

好了，现在公式和相关系数都出来了。

如图：

呵R的平方达0.996，线性相当好。

可是有时候有的项目是成指数增加的，散点图如下图，

从上图看并不值关，除了最大的一个点外其余的几乎都成了直线。

这不难理解，对于10000000而言，10与10000都差不了多少。

因此我们平时常使用半对数坐标纸画图。

对于Excel也可以，先点中Y坐标轴，再按右键，选“坐标轴格式”如下图

将左下方的对数刻度选中，确定。

完整的一个半对数标准曲线就做好了。

用Excel绘制标准曲线

将数据好输入Excel，并选取完成的数据区，并点击图表向导，如下图：

点击图表向导后会运行图表向导如下图，先在图表类型中选“XY散点图”，并选了图表类型的“散点图”（第一个没有连线的）。

点击“下一步”，出现如下图界面。

如是输入是如本例横向列表的就不用更改，如果是纵向列表就改选“列”：

如果发现图不理想，就要仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，可以点击“系列”来更改，如下图：

如果是X值错了就点击它文本框右边的小图标，结果如下图：

在表上选取正确的数据区域，点击“下一步”，出现图表选项界面如下图，调整选项，以满足自己想要的效果：

点击“下一步”，一张带标准值的完整散点图完成，如下图：

现在要根据数据进行回归分析，计算回归方程，绘制出标准曲线：

先点击图上的标准值点，然后按右键，点击“添加趋势线”。

如下图：

本例是线性关系，在类型中选“线性”，如下图：

点击“确定”，标准曲线回归画好：

回归后的方程是什么样呢？

点击趋势线（也就是标准曲线）然后按右键，选趋势线格式，如下图：

在显示公式和显示R平方值（直线相关系数）前点一下，勾上。

再点确定，公式和相关系数都出来了。

如图：

由此标准曲线可得出浓度：

切换到“选项”标签页，选择“显示公式”，确定。

在图表中出现一个公式，即浓度对吸光度的关系。

在单元格中输入该公式（其中的X值用具体的单元格引用代替），即可根据该公式计算出样品的浓度。

有时候有的项目是成指数增加，散点图如下图：

从上图看并不相关，除了最大的一个点外其余的几乎都成了直线。

这不难理解，因为对于10000000而言，10与10000都差不了多少。

因此我们平时常使用半对数坐标纸画图。

对于Excel，先点中Y坐标轴，再按右键，选“坐标轴格式”如下图：

将左下方的对数刻度选中，确定。

完整的一个半对数标准曲线就做好了：

利用Excel制作标准曲线，如果认真调整参数可以得到不同的效果。

绘图时最好用XY散点图。

生成图表后，选择生成的曲线，之后在曲线上点击右键，选择“添加趋势线”，在“类

型”中，选择最接近的曲线形式。

比如你的曲线接近线性，则选择“线性”，若接近乘幂的形式，则选择“乘幂”，如果比较难判断，则选择“多项式”，并调整其阶数。

荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制

1.绝对定量定义

绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算样品的量。

将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。

以标准品拷贝数

的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对样品进行

定量时，根据样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。

*Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标

准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系

*由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量

2.绝对定量标准品

标准品的一些标准

*必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同

*标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微

量分光光度计）

*标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）

*在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值

标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片

段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是

所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。

3.标准品的制备

一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保

证定量的准确性。

一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适

当减少重复的次数。

倍比梯度稀释方法：

1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii

1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii

1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv

1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v

依次倍比稀释

拷贝数的计算：

详见核酸拷贝数的计算

4.实例

标准品的制作：

将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700测得其拷贝数1.55×

108copy/ul

标准曲线的绘制（1cycle=1min）

设置对照：

浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、

1.55×102、1.55×101的标准样品各一个，设空白对照

PCR反应：

以不同浓度标准品作为模板

标准品的扩增曲线

标准品的溶解曲线

标准品的标准曲线图

扩增效率（E）计算：

E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=（2.04-1）×100%=104%

若样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：

即19.11=34.29-3.23X，所以X=（19.11-34.29）/（-3.23）=4.7

Quantityunknow=104.7=50118copies

核酸拷贝数的计算

一、分步推理如何计算核酸拷贝数

1A260吸光度值=dsDNA50ug/ml=ssDNA33ug/ml=ssRNA40ug/ml

核酸浓度＝（OD260）×（dilutionfactor）×[33或40或50]=ng/ul

MW代表克/摩尔，单位dolton：

1dolton即表示1g/mol

1摩尔=6.02x1023摩尔分子（拷贝数）

平均分子量（MW）：

dsDNA=（碱基数）×（660道尔顿/碱基）

ssDNA=（碱基数）×（330道尔顿/碱基）ssRNA=（碱基数）×（340道尔顿/碱基）

得到拷贝数计算公式：

（6.02x1023拷贝数/摩尔）×（浓度）/（MWg/mol）=copies/ml.

即（6.02x1023）×（g/ml）/（DNAlength×660）=copies/ml.

或（6.02×1023）×（ng/ul×10-9）/（DNAlength×660）=copies/ul.

例：

3000碱基质粒，浓度100ng/ul

MW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltons，即1mol=1.98×106g

（100ng×10-9）g/1.98×106＝摩尔数

copy数＝摩尔数×6.02×1023＝3×1010copies/ul.

二、这是一个小小的计算器，使你计算更加方便快捷，免去算数之苦……

什么是拷贝数？

.bioask./html/540.html

如何计算拷贝数？

计算方法：

（6.02×1023拷贝数/摩尔）×（浓度g/ml）/（MWg/mol）=copies/ml

[平均分子量（MWg/mol）：

dsDNA=（碱基数）×（660道尔顿/碱基）；ssDNA=（碱基

数）×（330道尔顿/碱基）；ssRNA=（碱基数）×（340道尔顿/碱基）]

将甲醛标准样品稀释成10ug/ml，2~5℃贮存。

取7支25ml具塞比色管按下表绘制标准色列：

于上述标准系列中，用水稀释定容至10.0ml刻线，加0.25%乙酰丙酮溶液

2.0ml，混匀，置于沸水浴中加热3min，取出冷却至室温，用1cm吸收池，以水为参比，于波长413nm处测定吸光度。

将上述系列标准溶液测得的吸光度A值扣除试剂空白（零浓度）的吸光度A0值，便得到校准吸光度y值，以标准吸光度y为纵坐标，以甲醛含量x（ug）为横坐标，绘制标准曲线，或用最小二乘法计算其回归方程式。

注意零浓度不参与计算。

y=bx+a式中：

a——校准曲线截距；B——标准曲线斜率。

由斜率倒数求得校准因子：

Ba=1//b样品测定

将吸收后的样品溶液移入50ml或100ml容量瓶中，用水稀释定容，取少于10ml试样（吸取量视溶液浓度而定），于25ml比色管中，用水定容至10.0ml刻线，以下步骤按标准曲线的绘制过程进行分光光度测定。

表3：

葡萄糖标准曲线光密度

标准曲线的绘制：

以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

曲线如下：

表4洗脱峰与酶原液活性测定数据记录表

酶活力单位的定义：

此反应条件下，温度40℃，PH=5.6,以

反应1min转化1mol还原糖为1U。

酶原液的光

密度为=0.2352%淀粉为底物，

酶原液所还原的葡萄糖含量=0.235÷0.0006=391.7ug淀粉酶活力的测定=391.7/180/0.5/10=0.435则1mL唾液淀粉酶的酶活力=10×0.435=4.35

洗脱峰1的光密度为=0.079

洗脱峰1所还原的葡萄糖含量=0.079÷0.0006=131.7洗脱峰1活力的测定=131.7/180/0.5/10=0.146则1mL洗脱峰1的淀粉酶活力=10×0.146=1.46

洗脱峰2的光密度为=0.476

洗脱峰2所还原的葡萄糖含量=0.476÷0.0006=793.3洗脱峰2活力的测定=793.3/180/0.5/10=0.881则1mL洗脱峰2的淀粉酶活力=10×0.881=8.81洗脱峰3的光密度为=0.079

洗脱峰3所还原的葡萄糖含量=0.079÷0.0006=131.7洗脱峰3活力的测定=131.7/180/0.5/10=0.146则1mL洗脱峰3的淀粉酶活力=10×0.146=1.46

?

134?

地方病通报xx年第22卷第4期EndemicDiseasesBulletinxxVol.22,No.4

:

100023711（xx）04xx4202

分光光度法中制作标准曲线及影响因素

周敏聪

（奎屯市自来水公司,奎屯834500）

3

关键词:

分光光度法;标准曲线;绘制

:

R123.1

:

A

标准曲线是直接用标准溶液制作的曲线,是用来描述被测物质的浓度（或含量）在分析仪器响应信号值之间定量关系的曲线。

在分光光度法分析中,被测物质的浓度在仪器上的响应信号值在一定范围内呈直线关系,曲线上查出。

因此标准曲线制作的好坏,准确度。

1标准曲线的表达式

2.3截距（a）:

是实验误差在y

（或x）,y值

a,,,随机误差总是存在的,若存在显著的系统误差或操作误差,测得a值较大时（|a|>0.010）应找出原因后,重新绘制标准曲线。

3影响标准曲线线性关系的因素

3.1分析法自身的精密度:

如当显色反映的灵敏度不高时,被

标准曲线应是一条通过原点的直线,如果坐标上各浓度点

基本在一条直线上可不进行回归处理,但在实验中不可避免地存在测定误差,往往会有一、二点偏离直线,此时可用最小二乘法进行回归分析,然后绘制曲线,通常称为回归直线,而代表回归直线方程叫回归方程,表达式为:

y=bx+a（式中:

b为直线斜率,a为y轴上的截距,x为被测溶液的浓度,y为吸光度,是多次测定结果的平均值）。

在实际工作中,制作标准曲线的目的,是要借助它来查出水样中被测物质的浓度,而不是由x值通过回归方程去求得最可靠的y值,为了便于将观察到仪器响应信号值代入回归方程中直接计算试样的浓度或含量,勿需去绘制标准曲线再从曲线上查出被测物的浓度,改用下式计算;x=by+a（式中:

a为x轴线上的截距,其它解释同前）。

2标准曲线的参数

标准曲线有3个参数,即相关系数r,斜率b和截距a。

2.1相关系数（r）:

相关系数是表示变量x与y之间的线性关系的密切程度。

如果r=1则所有点都落在一条直线上,y与x完全呈现线性关系,但在分析中总存在随机误差,所以,一般r≥0.999即可它无量钢,取至最后一个9后面保留一位数字,不进行数值修约。

当相关系数太差时,其实验水平受到怀疑,应查找原因,重新绘制标准曲线。

为了使回归方程比较好,在制作标准曲线的实验中应细心操作,最好在每个浓度点特别是高、低浓度点作重复测定3次,取平均值来计算回归方程。

2.2斜率（b）:

某种分析方法的斜率在实验条件基本一致的情况下是相对稳定的,斜率是检验分析方法灵敏度的,因此当斜率出现异常数据（超过相当偏差的2.5%）时,就要寻找原因。

我们使用的是721分光光度计,若使用其它灵敏度较高的分光光度计（如7230型分光光度计）测得的b值会略高一些。

测物低于某一浓度就不能显色,当显色溶液中的掩蔽剂或缓冲液能够络和少量被测离子,就会使标准曲线线性关系不好或不通过坐标原点,如用铬酸钡分光光度法测定水中硫酸盐,用双硫腙分光光度法测定水中锌,用离子选择电极法测定氟化物时,在标准曲线的低浓度就有可能有此现象。

3.2测定用仪器（包括量具）的精密度:

如单色光纯度不够,因为分光光度法中要求在最大吸收峰处测定吸光度,因此要求分光光度计的有效谱带宽度越窄越好,有利于获得纯度高的单色光,当单色光纯度不够时,测定的吸光度偏低。

3.3易挥发的溶剂所引起的测定溶液浓度的改变:

如双硫腙分光光度法测定水中的锌、铅、镉、4-氨基安替比林分光光度法测定挥发酚,亚甲蓝分光光度法测定阴离子合成洗涤剂时,所用的四氯化碳、氯仿溶剂,因其挥发性在实验过程中因时间问题,均会使测定的溶液浓度增大,使吸光度的重现性较差。

3.4污染:

制作标准曲线的操作步骤中,有无损失或玷污,当空白值较高时,纯水,试剂的加入量是否一致。

3.5分析人员操作*:

实践证明,制作标准曲线所得的一组浓度与仪器响应信号值对应点,往往不是以函数关系严格地分布在一条直线上,而是有一定程度的偏高,如果测定方法是稳定的,实验操作也是严密的,则各实验点很可能接近于一条直线。

反之如pH值的控制,温度的控制,比色时间,加液的速度,振摇时间和强度,器皿洗涤,测量误差等方面控制不当,都有可能造成误差。

4其他有关问题

4.1有效数字:

在标准曲线的3个参数中,一般相关系数至少

取3位,最好是4位数,斜率b的有效数字应于自变量的有效位

3:

xx-04-01

作者简介:

周敏聪（1976-）,女,助理工程师

1

地方病通报xx年第22卷第4期EndemicDiseasesBulletinxxVol.22,No.4

数相等或最多比自变量多保留1位。

截距a的有效位数应与因变量的有效数相同或最多比因变量有效位数多保留1位。

4.2空白值:

空白值影响测定方法的检出限和最低检测浓度,也影响测定结果的重现性,特别是对低浓度样品的测定,因此应引起足够的重视。

影响空白值大小的主要因素,包括纯水中的杂质,试剂玷污或失效,操作过程的玷污,实验条件的异常变化等等。

这些因素对测定*程度经常变化,并非是一恒定的数值。

但在同一组测定中,这些因素对每一测试结果*基本一致。

因此在每组测定中进行空白试验是十分必要的,由于空白值与诸多因素有关,且是影响测定结果准确度的重要指标,因此应对其严格控制,并可作为化验室自我评价的重要依据。

在测试工作中应设法降低空白值,当空白值过高时,应根

?

135?

据其主要影响因素,全面进行检查。

4.3制作标准曲线的实验点:

有推荐实验点数n=5。

因为在95%的置信水平,自由度数目函数的t值,在n=4或5时,t下降缓慢。

实验点少,可减少工作量,但这5个点分布在整个线性范围内,由于仪器和方法的原因,两端点的测定误差较大,比较可靠的实验点只有3个,因而给样品的测量值带来一定的误差,所以制作标准曲线的实验点为7个较好。

制作标准曲线的器皿,应经过校准,配套专用。

在分光光度计中,标准曲线的制作是测定结果准确与否的关键所在,只有我们在实验中细心操作,减少系统误差和随机误差,如果测定方法是稳定的,实验操作是严密的,对各种影响进行适当控

（本文:

阮红）制,。

:

100023711（xx）04xx5202

”现状及对策

沈学枝,冯将军

1

2

3

（1.生产建设兵团农五师疾病预防控制中心,博乐833400;

2.兵团农五师党校,博乐833400）

关键词:

结核病;控制;“三级网络”

:

R521;R181.3

:

A

结核病控制项目在生产建设兵团农五师启动后,各师开展结核病控制项目工作之间存在较大的差异。

根据兵团结核病控制项目启动后工作开展现状分析,结核病控制工作的重点应该在团场,在基层。

本文就我师结核病控制工作如何建立、健全结核病控制项目管理“三级网络”进行探讨。

1结核病控制工作现状

（1）体制方面的原因:

农五师结核病防治三级网络不够健

全,没有起到应有作用。

为降低结核病发病率、保障广大职工群众身体健康,针对我师实际,已逐渐建立起了师、团、连结防三级网络,但没有发挥应有的作用。

由于师级结防人员对团和连级无行政隶属、经济制约关系,“三级网络”之间没有建立相互制约、相互促进机制,结果是师级布置任务,团级应付,连级不执行。

即使是上级部门检查,也是临时应付。

团场为维持生存和发展,出于自身经济利益考虑,重临床、轻防疫、轻基层。

医院截留结核病人,也是造成病人因没有正规管理而产生耐药和重复治疗的重要原因之一。

（2）结核病人发现率及管理质量:

总体来说,结核病发现水平和管理水平是在逐年提高,但与经济发展和社会进步的步伐相比,结防工作质量的提高相对缓慢。

具体体现是“软件不精”,师、团、连三级管理不到位,监督指导能力弱,人才缺乏,业务技术水平不高,结防人员整体素质较差;“硬件不硬”,大多数

师、团的设施相对陈旧落后、不全;使结防工作的正常开展受到

制约,更谈不上结核病人的发现和规范治疗。

（3）执法和健康教育:

我国传染病防治法颁布实施后,为结核病防治工作的开展提供了法律依据,为搞好结核病防治工作提供了强有力的支持。

但也应该看到卫生行政部门、卫生执法监督部门执法力度不够,受到人情、关系网和部门利益等因素影响,对卫生违法行为不及时查处或查处不严,致使有发现结核病人迟报或不报等违法行为时有发生。

由于结核病健康教育力度不够,导致广大职工群众对结核病防治工作认识不到位,各级政府领导不重视,相关部门不配合,使结核病患者不能自觉自愿地接受结防人员服务,严重影响了结核病人的归口管理和DOTS策略执行。

2对师结防工作的思考

（1）强化行政部门对基层结防工作的责任,加强基层网络

建设。

政府承诺,经费落实,是做好结核病控制工作的保障。

各级主管部门要对结核病控制项目工作全面负责,