放射损伤对小鼠骨髓间充质干细胞成骨潜能及造血干细胞龛位的影响.docx
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放射损伤对小鼠骨髓间充质干细胞成骨潜能及造血干细胞龛位的影响
放射损伤对小鼠骨髓间充质干细胞成骨潜能及造血干细胞龛位的影响
(作者:
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___________邮编:
___________)
作者:
马杰,史明霞,李炳宗,李静,房佰俊,孙慧,赵春华【摘要】 目的观察放射对小鼠骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)体外成骨潜能及体内骨髓造血干细胞(hematologicstemcells,HSCs)龛位的影响。
方法分离、培养正常及接受4Gy放射后不同时间点小鼠BMMSCs,用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)染色法和实时定量RTPCR检测成骨分化相关基因,鉴定BMMSCs体外成骨分化潜能的改变,并通过骨组织形态学和免疫组织化学的方法检测放射后小鼠体内成骨细胞及纺锤形的、表达神经钙黏附分子的成骨细胞(spindleshapedNcadherinexpressingosteoblasts,SNOs)数量的变化。
结果全身照射(totalbodyirradiation,TBI)后早期小鼠BMMSCs的成骨潜能增强,但随后迅速降低;TBI后28d小鼠骨髓中成骨细胞和SNOs的数量均显著减少。
结论4Gy放射损伤后远期小鼠BMMSCs的成骨潜能显著降低,体内HSCs龛位也明显缩小。
【关键词】目的观察放射对小鼠骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)体外成骨潜能及体内骨髓造血干细胞(hematologicstemcells,HSCs)龛位的影响。
方法分离、培养正常及接受4Gy放射后不同时间点小鼠BMMSCs,用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)染色法和实时定量RTPCR检测成骨分化相关基因,鉴定BMMSCs体外成骨分化潜能的改变,并通过骨组织形态学和免疫组织化学的方法检测放射后小鼠体内成骨细胞及纺锤形的、表达神经钙黏附分子的成骨细胞(spindleshapedNcad ABSTRACT:
ObjectiveToinvestigatetheeffectsofirradiationontheosteogenesispotentialofbonemarrowmesenchymalstemcells(BMMSCs)andthenicheofhematopoieticstemcells(HSCs)invivo.MethodsAtthedifferenttimepointsafter4Gyirradiation,BMMSCswereisolatedfrommaleC57BL/6miceandcultured.TheirosteogenesispotentialsinvitrowereevaluatedbyalkalinephosphatasestainingandosteogenesisrelatedgeneexpressionwasexaminedbyrealtimeRTPCR.BonehistomorphometricanalysisandimmunohistochemicalstainingofthespindleshapedNcadherinexpressingosteoblasts(SNOs)wereperformedtodetectthechangesinHSCsnicheinvivo.ResultsSignificantimpairmentofosteogenicdifferentiationofBMMSCsupto28daysafterirradiationwasobservedprecededbytransitoryenhancementattheearlytimeafterirradiation.Meanwhile,thenumberofosteoblastsaswellasSNOsinvivodecreasedgreatly.ConclusionIrradiationresultedindamageinosteogenesispotentialofBMMSCsaccompaniedbynoticeableshrinkingofHSCsnicheinvivo. KEYWORDS:
irradiation;bonemarrowmesenchymalstemcells(BMMSCs);osteogenesispotential;hematopoieticstemcells(HSCs)niche 骨髓是对放射较为敏感的组织器官,放射后造血系统的损伤不仅包括早期的急性骨髓造血功能抑制,还包括晚期残存的造血功能障碍。
造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSCs)凋亡、自我更新能力减低及HSCs池缩小以及HSCs衰老[13]被认为是放射后造血系统短期和长期损伤的主要原因。
然而HSCs在体内的存在并不是孤立的,其生物学行为与功能受其所在微环境或龛位(niche)的调控。
骨和骨髓在解剖上的毗邻使其在功能上也相互依赖,成为一个功能单位[4],骨发育或骨重塑异常的突变小鼠同时也存在造血生成异常,提示成骨细胞和/或破骨细胞参与了骨髓HSCs微环境或龛位的形成和功能维持[57]。
目前认为成骨细胞或其中的一个亚群,即纺锤形的、表达神经钙黏附分子的成骨细胞(spindleshapedNcadherinexpressingosteoblasts,SNOs)作为HSCs龛位的骨龛(osteoblasticorendostealniche)中的关键细胞成分,限定造血龛位的大小和/或活性[5,78]。
虽然以往关于大剂量化疗和/或放疗对骨髓基质微环境的影响有一些报道,但有关放射对HSCs龛位的影响尚未见报道。
本研究着眼于成骨细胞的祖细胞——BMMSCs在放射损伤后成骨潜能的变化来探讨放射损伤对HSCs龛位的影响,旨在进一步阐明放射损伤后长期造血功能损伤的可能机制。
1材料与方法 1.1实验动物及辐射损伤模型制备 5周龄雄性C57BL/6小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所,实验动物随机分为正常对照组和全身照射组,后者经137Cs射线进行一次性全身照射4.0Gy,吸收剂量率为2.4Gy/min。
每批动物分别在照射后的0、1、3、7、14、28d取材,所得到的BMMSCs分别命名为D0、D1、D3、D7、D14和D28。
1.2主要试剂和仪器 Flk1抗体(美国SantaCruz公司);CD34、CD45、CD31、GlyA、vWF、CD11a、CD11b抗体(晶美生物工程有限公司);RealtimePCR试剂盒(德国QIAGEN公司);RealtimePCR仪(ABIPRISM7500,美国AppliedBiosystems公司);碱性磷酸酶染色试剂盒(中国医学科学院血液病研究所科技公司);兔多克隆抗NCadherin抗体(英国Abcam公司);即用型过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(Zymed公司);PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。
1.3小鼠BMMSCs的分离和培养 无菌状态下取雄性C57BL/6小鼠股骨和胫骨,冲出骨髓,经4号针头反复冲洗,制成单细胞悬液。
用FicollPaque(1.077g/mL)分离出骨髓单个核细胞(bonemarrowmononuclearcells,BMMNCs),用MACSCD45、GlyA和CD34磁珠去除造血细胞,以107个/mL密度接种在25cm2的培养瓶内。
培养液成分为400mL/LMCDB、550mL/LDF12、40mL/L胎牛血清、100u/mL青霉素和1000u/mL链霉素,置于37℃、50mL/LCO2培养箱培养。
24h后去掉悬浮细胞,细胞融合达70%时,用1.25g/L胰酶消化并以1∶2比例传代。
这些细胞的免疫表型为CD34、CD45、CD31、vWF、GlyA、CD11a、CD11b阴性,Flk1阳性(资料未显示)。
1.4成骨的定向诱导分化 以2×104/cm2的密度将小鼠BMMSCs接种于含有成骨诱导培养体系(100mL/L胎牛血清、1.0×10-8mol/L地塞米松、2.0×10-4mol/L抗坏血酸、7.0×10-3mol/Lβ磷酸甘油的IMDM培养液)的T25cm2培养瓶或35cm2的培养皿中,置于37℃50mL/LCO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养,每天观察1次,每3d半量换液1次。
1.5碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)染色 正常及全身照射(totalbodyirradiation,TBI)后1、3、7、14、28d的小鼠BMMSCs体外成骨诱导分化1周时倾出培养皿中的培养液,PBS洗细胞2次;加固定液2mL,室温固定1min,流水漂洗2min;加作用液2mL,置湿盒内于37℃孵育2h,流水冲洗2min;加染色液2mL,复染5min,流水冲洗2min;甘油封固,倒置显微镜下观察,胞质出现蓝紫色沉淀的为阳性细胞。
1.6荧光实时定量RTPCR(realtimeRTPCR) 正常及照射后1、3、7、14、28d的小鼠BMMSCs体外分别成骨诱导1周或3周后,用Gibco公司的Trizolregeant提取其总RNA,参照说明书逆转录后的cDNA产物,以βactin为管家基因,应用嵌入荧光染料SYBRGreenI进行荧光定量PCR扩增,检测成骨分化相关基因核心结合因子(corebindingfactor1,Cbfa1)、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,ColⅠ)和骨钙蛋白(osteocalcin,OC)的表达变化。
25μL扩增体系中含ROX0.5μL,2×Premix12.5μL,上游和下游引物各1μL,模板cDNA1μL,DEPC水7μL。
所用引物及退火温度见表1。
表1用于实时定量RTPCR的成骨分化相关基因引物序列(略) 1.7骨组织标本的制备及苏木素 伊红染色(HE染色)在放射后不同时间点处死模型和正常小鼠,取出股骨,剔除骨表面附着的软组织,按常规的方法制备5μm的脱钙石蜡切片,进行HE染色,并参照ZHANG等[8]的方法,计数每张切片中皮质骨和小梁骨表面成骨细胞数。
1.8NCadherin阳性细胞的免疫组织化学检测 上述脱钙的石蜡包埋的骨组织切片常规脱蜡至水,按照试剂盒说明书,采用SP法进行NCadherin的免疫组织化学染色,微波煮沸抗原修复。
兔多克隆抗NCadherin抗体的浓度为1∶200稀释。
显色采用DAB法并经苏木素复染,参照ZHANG等[8]的方法,计数每张切片的SNOs。
每次都做不加一抗的阴性对照片。
1.9统计学分析 实验数据采用均数±标准差表示,应用SPSS12.0软件进行统计学处理,多个样本均数的比较采用方差分析,两两比较采用StudentNewmanKeuls法(SNK法),以α=0.05为显著性检验水准。
2结果 2.1放射损伤后小鼠BMMSCs成骨潜能的改变 接受4Gy放射后小鼠BMMSCs体外均能向成骨细胞分化,但其分化潜能却存在着较大差异。
放射前后不同时间点BMMSCs在成骨诱导培养基中诱导1周后,细胞变大,扁平(图1),进行ALP染色,发现ALP阳性细胞的数量在放射后第3天BMMSCs的成骨分化体系中明显增多,聚集成片,且着色较深(图1C),而在放射后第7天BMMSCs的成骨分化体系中明显下降(图1D~图1F),至放射后28d时仍未见明显恢复(图1F)。
2.2放射损伤后小鼠BMMSCs成骨分化相关基因表达变化 成骨细胞分化过程伴随着一些成骨分化相关基因的表达。
体外成骨诱导1周后,与成骨分化相关的Cbfa1、ColⅠ和OC在放射损伤后第3天BMMSCs中表达最高,第28天表达最低。
在成骨体系中培养3周,TBI后3dBMMNCsCbfa1的表达仍然最高,但ColⅠ和OC的表达最低;不同的是ColⅠ和OC的表达在TBI后28d达高峰,TBI后3d最低(图2)。
提示虽然放射损伤后早期小鼠BMMSCs的成骨分化潜能明显增强,但最终其成骨分化的能力显著降低,在放射后28d未见恢复的倾向。
2.3放射损伤后体内骨组织形态学和成骨细胞的改变 正常小鼠股骨近端干骺端骨小梁丰富,骨小梁排列以纵向为主,之间互相连接,形态结构完整(图3A、图3F)。
而放射损伤后,股骨近端干骺端骨小梁排列逐渐稀疏,间隙增宽,形态结构性差,皮质骨变薄。
部分骨小梁断裂及部分区域骨小梁消失出现于放射后第7天(图3C、图3H),以第28天时表现最为显著(图3E、图3J)。
正常小鼠成骨细胞紧密地排列于骨小梁和皮质骨表面(图3A、图3F),而放射后骨小梁和皮质骨表面成骨细胞逐渐减少直至消失(图3B~图3E、图3G~图3J)。
计数正常和放射后第28天时每张HE染色切片的成骨细胞数量可见TBI后28d时小鼠体内成骨细胞的数量显著减少(图5A)。
2.4放射损伤后HSCs龛位的改变 近来认为成骨细胞的一个亚群,即SNOs是HSCs龛位中骨龛的关键细胞成分[5,78]。
正常小鼠骨髓中骨小梁表面含有较多的NCadherin+细胞,包括SNOs和NCadherin+、卵园形的成骨细胞(图4A)。
而放射后28d,皮质骨及骨小梁表面成骨细胞数量显著减少(图3B~图3E、图3G~图3J),仅在骨骺和皮质骨交界处骨小梁相对较丰富的地方可见到少量的SNOs(图4B),其数量较正常减少近70%(图5B)。
3讨论 随着对BMMSCs生物学特性和HSCs龛位研究的深入,BMMSCs在造血功能的起始和维持中的作用逐渐被认识。
BMMSCs能生成绝大多数的骨髓基质细胞,构建HSCs赖以生存的微环境[910],并且它还是成骨细胞的来源,而后者则被认为是HSCs龛位中的关键细胞成分,参与对HSCs的调控[5,78]。
已有研究证实BMMSCs不仅为一些疾病的治疗带来了新的希望[11],其生物学特性的改变还参与了一些疾病的发生和发展[1213]。
本研究发现放射损伤晚期BMMSCs成骨潜能明显降低,同时体内成骨细胞数量明显减少,HSCs龛位显著缩小。
体外诱导成骨分化1周时,放射损伤后晚期(28d)BMMSCs的成骨分化体系中ALP阳性细胞数量明显减少,其成骨分化相关基因的表达均显著低于正常。
ColⅠ是成骨分化过程的早期标志之一,在钙质沉积将结束时表达降低,而OC在成骨分化的终末阶段即分化至骨细胞和骨衬细胞时则不表达。
本实验显示体外诱导分化3周即成骨细胞分化以成熟基质矿化为特征时,TBI后28dBMMSCs成骨分化相关基因ColⅠ和OC高表达,提示分化的成骨细胞仍然处于一个早期的不成熟阶段,说明放射损伤后BMMSCs的成骨分化潜能明显减弱。
而在放射后早期(3d),BMMSCs的成骨潜能有明显增强,这可能是因为机体受到放射损伤后,BMMSCs通过成骨能力的增强来尽力维持体内骨髓微环境的稳定,但是这种代偿功能是有限的。
近年关于HSCs龛位的研究取得了突破进展。
在一些特殊的转基因小鼠模型中,成骨细胞数量的增加或减少直接与HSCs数量增加或减少相关[5,78],说明成骨细胞是HSCs龛位的重要组成部分,参与限定HSCs龛位的大小和/或活性。
ZHANG等[8]证实HSCs通过同型的NCadherin分子和成骨细胞接触,进而提出了骨内膜表面的专职SNOs是HSCs龛位的必需成分。
NCadherin同时表达于SNOs和HSCs,这种同型的NCadherin分子间的相互作用可能在HSCs锚定(anchor)于骨龛中起重要作用。
βcatenin是HSCs自我更新的关键调控因子[14],而在许多类型的细胞中,NCadherin和βcatenin构成了一个功能性的信号通路复合体,因而在HSCs龛位中,NCadherin介导的成骨细胞和HSCs的黏附可能通过βcatenin与WntLEF1Notch1信号通路相连,维持HSCs的自我更新能力,防止其分化。
本实验结果显示放射损伤后除了骨髓内骨组织形态学发生显著变化外,放射后第28天,成骨细胞也显著减少,而SNOs仅见于骨骺和皮质骨交界处骨小梁相对较丰富的地方,其数量也减少近70%,提示TBI后骨髓HSCs的骨龛也显著缩小。
HSCs和其龛位是一个功能整体,任何一方的改变均会导致造血系统功能损伤。
虽然以往认为HSCs本身自我更新能力减低、HSCs池的缩小以及HSCs细胞衰老[14]是放射损伤后远期造血功能损伤的机制,然而本实验结果提示放射损伤后BMMSCs成骨潜能的改变及其所导致的HSCs龛位的显著缩小可能也是导致放射后远期造血功能障碍的潜在机制之一。
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