分子生物学实验.docx

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分子生物学实验

实验一、基因组DNA的提取

一、实验目的：

1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理。

2.掌握DNA提取的方法和步骤。

二、一般原理

提取DNA的一般原理，是将分散好的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：

异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化

三、材料

植物组织

四、设备

移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管。

五、试剂

1、提取缓冲液：

100mmol/LTris·Cl,pH8.0,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。

2、80:

4:

16/氯仿:

戊醇:

乙醇

3、其它试剂：

液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc

六、操作步骤

1.在1.5ml离心管中加入500μl提取缓冲液,60℃水浴预热。

　2.植物组织0.1g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟（时间长,DNA产量高）,不时摇动。

　　3.加入500μl氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀（需带手套,防止损伤皮肤），室温下静置5分钟,使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。

4.室温下10000rpm离心2分钟。

　　5.仔细移取上清液至另一1.5ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6.10000rpm离心2分钟,去异丙醇上清液，（70%酒精洗涤，10000rpm离心2min，沉淀干燥，20μl的TE溶解即可）

沉淀干燥，加入200μlTE使其溶解。

这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

7.将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的1.5ml离心管。

　　9.加入5μlRNaseA（10μg/μl）,37℃10分钟,除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

　　10.加入1/10体积的3mol/LNaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。

11.10000rpm离心2分钟,去乙醇上清液，沉淀用70%乙醇漂洗；再10000rpm离心2分钟，沉淀干燥去干净乙醇。

　　12.将DNA重溶解于30μlTE,-20℃贮存。

　　13.取2μlDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。

同时取20μl稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。

原理：

核酸在260nm处有最大吸收峰

蛋白质在280nm处有最大吸收峰

盐和小分子在230nm处有最大吸收峰

DNA的紫外分光光度计检测

OD260/OD280>1.7

OD260/OD230>2.0

1OD260=50μg/mLDNA

二、质粒DNA的分离纯化

一、实验目的

从转化的大肠杆菌中获得大量重组的质粒，以进行DNA分析（酶切鉴定、DNA测序等）或进一步的进行转化研究。

二、原理

采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100可使细胞膜裂解。

经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA（CovalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。

等）

三、材料

含质粒的E.coliDH5α系列菌株，1.5ml的eppendorf管，离心管架。

微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。

四、试剂

1.LB固体和液体培养基：

2.3mol/lNaAc（pH5.2）：

50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。

　3.溶液Ⅰ：

50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。

溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。

　4.溶液Ⅱ：

0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS。

　5.溶液Ⅲ：

5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。

溶液终浓度为:

K+3mol/L,Acˉ5mol/L。

6.氯仿:

异戊醇（V/V）＝24:

1。

五、操作步骤

1、取培养至对数生长后期的含质粒的大肠杆菌培养液1ml，4℃下10000r/min离心1min,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。

　　2、将细菌沉淀物重新悬浮于150µL溶液I中,充分混匀，在室温下放置5min。

　　3、加入200µL新配制的溶液II,盖紧管盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴5min。

4、加150µL用冰预冷的溶液III,摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置5min,此时应形成白色絮状沉淀。

5、4℃下10000r/min离心5min。

　6、取上清液,加入等体积氯仿:

异戊醇,振荡混匀,4℃下10000r/min离心10分钟。

7、取上清液转入另一离心管，加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min；10000r/min离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体，真空干燥。

8、加1mL70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干，加pH8.0TE缓冲液备用（可以在-20℃保存）10～15µL。

思考题：

1.在实验过程中，加入的EDTA、SDS分别起什么作用？

2.乙酸钾在实验过程中主要起什么作用？

3.氯仿在核酸的提取过程中有何作用？

4.本实验整个过程要注意些什么？

三、感受态细胞的制备

一、感受态细胞的作用

当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌内，则必须以该技术使细菌细胞处于易接受质粒的状态，以大量获得这一质粒。

二、原理

将快速生长中的大肠杆菌（对数生长期）置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球），使细菌处于容易吸收外源DNA的状态。

三、材料

E.coliDH5α（或JM105）菌株：

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右（不同的菌株情况有所不同）,这时比较合适。

密度过高或不足均会影响转化效率。

其它材料还有无菌1.5mL的eppendorf管

四、试剂

1.LB固体和液体培养基：

胰蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl10g

5mol/L的NaOH调pH至7.0

2.0.05mol/LCaCl2（或0.1mol/L）

v所有试剂均需高温高压灭菌

五、操作步骤

１：

从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:

100-1:

50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。

２：

取1ml细菌培养物置于1.5mL的eppendorf管中，冰浴15min，4000rpm,离心1min，弃上清，冰浴放置

３：

用预冷的氯化钙（0.1MCaCl2，300l）悬浮菌体，冰浴放置5min,4000rpm,离心1min.弃上清

４：

用预冷的氯化钙（0.1MCaCl2，300l）悬浮菌体，冰浴20min，4000rpm,离心1min,弃上清

５：

加入300l预冷氯化钙悬浮菌体，放置于冰浴，即得感受态细胞,此细胞可现用,也可在4℃保存1周，或保存于-20℃或分装于无菌离心管中,投入液氮,快速冷冻然后储于-70℃保存

思考题：

1.感受态细胞制备过程中应注意什么？

2.感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域？

四、PCR

一、实验目的

1.掌握PCR技术的一般方法和原理。

2.了解PCR的应用技术

二、原理

类似于DNA的体内复制。

首先将待扩增的DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。

这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

三、引物设计原则

（1）引物长度约为15-30bp

（2）引物中G+C含量通常为40%-60%。

引物长度小于20时，引物的解链温度Tm＝4（G+C）+2（A+T）。

（3））四种碱基应随机分布，在3‘端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。

（4）在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构

（5）两引物之间尤其在3‘端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。

两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性

（6）引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基

三、材料

模板DNA为前次提取的质粒。

四、仪器

移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪，琼脂糖凝胶电泳所需设备（电泳槽及电泳仪），台式高速离心机。

　　五、试剂

1、10×PCR反应缓冲液：

500mmol/LKCl,100mmol/LTris·Cl,在25℃下,pH9.0,1.0％TritonX-100。

　　2、MgCl2：

25mmol/L。

　　3、4种dNTP混合物:

每种2.5mmol/L。

　　4、TaqDNA聚合酶5U/μl。

5、引物1和引物2的浓度均为10μmol/L

　　6、其它试剂：

矿物油（石蜡油），1%琼脂糖，5×TBE

五、操作步骤

PCR反应条件：

先94℃预变性5-10min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃保温10min反应结束后，取3LPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，其余置-20℃保存备用。

思考题：

1.降低退火温度对反应有何影响？

2.循环次数是否越多越好？

为何？

3.PCR技术可应用于哪些方面？

举例。