3蛋白质和蛋白质组学研究技术.docx
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3蛋白质和蛋白质组学研究技术
第3章：
蛋白质和蛋白质组学研究技术
奶汁是所有哺乳动物的营养源。
奶汁含有不同蛋白质。
用MALDI-TOF质谱技术研究奶汁的蛋白质组成，依靠它们的质量/电荷比将奶汁蛋白质各组分分开。
几乎在所有的生物过程中，蛋白质都起关键作用。
蛋白质参与生物反应的催化、细胞信号传递、和生物结构支持等。
它执行各种各样生物功能的基础是生物体内有成千上万种蛋白质，每种蛋白质度能折叠成独特的三维结构，从而与一种或几种分子相互作用。
生物化学的主要目标之一是确定氨基酸序列如何决定蛋白质构型，从而决定蛋白质功能。
生物化学的其它目标是了解各种蛋白质与底物或其他分子结合进而介导催化、能量和信息转导的机制。
这些研究的第一个工作常常是对目标蛋白进行纯化。
根据蛋白质溶解度、大小、电荷、和结合能力上的差异进行蛋白质分离。
纯化蛋白可以用来测定氨基酸序列。
自动多肽测序和重组DNA技术提供了大量的氨基酸序列数据（你可以在公共数据库上查询、下载相关蛋白质的氨基酸序列）。
有很多蛋白质序列是从基因组序列推测的。
如果纯化蛋白质序列已经列在数据库中，研究工作就比较容易做。
你只要测定一小段肽序，与数据库进行比较即可。
另外也可以进行分子质量比对，看看与数据库推测的质量是否吻合。
质谱是确定蛋白质质量的有效技术。
为了了解一个蛋白质的生理学背景，有必要制备出该蛋白质的抗体。
利用抗体确定蛋白质在活体内的位置、测定其含量。
可以大量制备能够确定特异蛋白质的单克隆抗体。
这些抗体能够用于检测分离状态的蛋白质和存在于细胞状态下的蛋白质，并进行蛋白质定量。
可以用化学方法合成多肽和蛋白质，这样制造的蛋白质可用于研究，也可满足高纯度药用蛋白的需求。
最后，x-射线晶体衍射技术和NMR谱是现在阐明蛋白质三维结构的主要技术。
而蛋白质三维结构是决定蛋白质功能的关键因素。
用一系列生理和化学技术对蛋白质进行的研究极大地促进了我们对生命分子基础的了解。
这些技术的应用使我们有可能在分子水平上攻克挑战性最大的生物学问题。
蛋白质组是基因组的功能表达形式
有很多生物的全基因组序列已经阐明。
例如，蛔虫（Caenorhabiditiselegans）的基因组有9700万碱基对，编码19000种蛋白质；果蝇基因组有1亿8千万碱基对，编码14000种蛋白质。
人的全基因组序列有30亿碱基对，编码25000种蛋白质。
但是这些基因组序列就像一个汽车的零配件清单——不能提供各个零配件所在位置以及各零配件所起的作用。
于是就产生了一个新领域，即蛋白质组，能够提供相应的功能信息。
蛋白质组包括功能蛋白质种类、功能、以及蛋白质之间的相互作用。
蛋白质组就是基因组表达的蛋白质群。
在特定的生物背景下，生物体内实际的蛋白质清单比基因组提供的清单内容小得多，即只有一部分基因表达。
蛋白质组能告诉我们哪蛋白质在发挥作用——如哪些蛋白质相互作用、形成信号传导途径或膜上离子通道。
蛋白质组不是细胞固定的特征。
由于蛋白质组是信息的功能表达形式，因此不同类型的细胞、同一类型不同发育状态的细胞、记忆处于不同环境的同一类型细胞将有不同的蛋白质组。
由于生物能用不同方式进行修饰几乎所有的基因产物蛋白质，因此蛋白质组比基因组大得多。
而且蛋白质组的蛋白质都不是以隔离状态存在的，而是与其它蛋白质相互作用来执行特定的生物功能。
与基因组不同，蛋白质组不是静态的。
对蛋白质进行研究、鉴定、归类，从而了解蛋白质组。
在有些情况下（但不是在所有情况下），这类研究最开始是要从细胞中分离出特定蛋白质。
4.1研究蛋白质功能的第一步是蛋白质纯化
生物化学有个谚语：
“别在不纯的蛋白质上浪费完美的思路。
”用纯化的蛋白质我们能够确定蛋白质的氨基酸序列，研究蛋白质的生物化学功能。
根据氨基酸序列，我们能够绘制不同物种同一蛋白质的进化关系图（第六章）。
纯化蛋白质能够生长出蛋白质晶体。
我们用蛋白质晶体能够进行x-射线衍射、从而确定蛋白质的空间结构，这种空间结构又与蛋白质功能密切相关。
如何判断哪个蛋白质就是我们所需要的蛋白质？
-检测
纯化的目的是获得只有一种蛋白质（我们感兴趣的）的样品。
该蛋白也许只有起始原料的1%，而起始原料是培养细胞或植物特定器官所有蛋白质的混合物。
生化工作者如何从复杂的蛋白质混合物种分离出特定的蛋白质呢？
生化工作者做检测，即检查样品是否具有目标蛋白独特的性质。
检测阳性表示样品有目标蛋白。
确定检测的有效性常常很困难，但是检测的性质愈特异，纯化方案逾有效。
例如酶的检测就是测定酶的催化活性——即酶促进特定生化反应的能力。
酶活性检测常常是间接测定。
乳酸脱氢酶催化下列反应：
还原的烟碱腺苷二磷酸（NADH）在340nm有吸收峰，但氧化型NAD+在340nm没有吸收峰。
因此我们能根据一定时间内（如1分钟）反应在所产生的光吸收量判断样品的酶量。
如果乳酸脱氢酶纯化过程中，样品催化乳酸脱氢反应（1分钟内）产生的340nm光吸收值逐步增加，说明酶的纯度逐步提高。
为了判断我们的纯化方案是否可行，我们还需要知道样品中蛋白质含量。
有不同的方案快速准确测定蛋白质浓度。
用两个实验测得的参数——酶活性和蛋白质浓度——我们能够计算样品的比活性（specificactivity）。
比活性是样品的酶活性与蛋白质总量之间的比值。
理想状态下，纯化过程中样品的比活性愈来愈高，所获得的乳酸脱氢酶含量愈来愈大。
纯化的总目标是让比活性最大化。
纯净酶的比活性是一个常数值。
胞内蛋白质的纯化必须从细胞内释放出来
建立检测方案并确定蛋白质来源后，我们将细胞内容物分离成不同组分并确定哪个组分含含有最多的目标蛋白。
具体分离方案取决于所要纯化的蛋白质性质或者根据先前经验进行一系列的尝试。
在第一步，我们要破坏细胞膜，并用离心的方法将细胞匀浆液分离成底部沉淀（密度高的重材料）和上清液（图3.1）。
上清液进一步用更大的离心力离心产生另一种沉淀和上清液。
这种离心方案叫差异离心（differentialcentrifugation），如此生成密度更小的组分。
每个组分含有几百种不同的蛋白质。
测定离心产生的各个组分的目标蛋白活性。
其中活性最高的组分用作起始原料，用分离效果更好的纯化技术进一步纯化。
图3.1差异离心。
用匀浆器匀浆破坏细胞，所形成的混合物叫匀浆液。
分步增加离心机的离心力。
能够将密度不同的颗粒沉淀到离心管底部（先是高密度、后是此高密度，如此递减）。
用这种方法分离的不同组分用于后续进一步纯化。
[PhotographscourtesyofDrS.FleischerandDrB.Fleischer.]
可以利用蛋白质的溶解度、大小、电荷和亲和力的差异纯化蛋白质
利用蛋白质的溶解度、大小、电荷和亲和力的差异已经纯化了几千种有活性的蛋白质。
通常将蛋白质混合物进行一系列步骤的纯化操作，各步纯化操作所利用的蛋白质性质不同。
每个纯化步骤都要测定蛋白质活性和蛋白质浓度。
有不同的蛋白质纯化技术。
盐析。
大多数蛋白质在高盐浓度的溶解度差，这种效应叫盐析（saltingout）。
各种蛋白质发生沉淀的盐浓度不同。
因此盐析可以用来分离蛋白质。
例如0.8M硫酸铵能沉淀纤维蛋白原（血液凝固蛋白），而血清白蛋白沉淀所需的盐浓度是2.4M。
盐析能用来浓缩浓度稀的蛋白质，以及用来浓缩其它纯化方法分离的蛋白质。
然后用透析的方法除去盐（如果需要）。
透析。
透析能够除去蛋白质溶液的小分子物质。
这些小分子物质能够透过半透膜（如有孔的纤维素膜）（图3.2）。
比透析膜孔大的分子不能透过半透膜而滞留在透析袋内；比膜孔小的分子或离子将透过半透膜进入透析液。
该技术在脱盐和除去其它小分子方面很有用，但对蛋白质组分的分离没有意义。
图3.2透析。
蛋白质分子（红色）滞留在透析袋内，而小分子（蓝色）扩散到透析液中。
凝胶过滤层析。
该技术能更为有效的依靠分子大小分离蛋白质。
凝胶过滤层析也叫分子排阻层析（图3.3）。
层析介质是高度亲水的、水不溶的、多孔聚合物珠如葡聚糖、琼脂糖、或聚丙烯酰胺。
Sephadex,Sepharose，和Biogel是常用的分子排阻层析的商品介质，其直径是0.1μm。
层析时，直接将蛋白质溶液上样到充满层析介质柱的顶部。
小分子能够进入层析介质珠孔内，大分子物质不能。
结果小分子物质在层析介质珠内外都有，而大分子物质至在层析介质珠之间。
因此大分子能快速流出层析柱，而小分子流出层析柱所需时间长。
而那些分子大小介于大分子和小分子之间的蛋白质，因偶尔能够进入层析珠内，其流出层析柱的时间介于两者之间。
图3.3凝胶过滤层析。
将小体积的蛋白质溶液上样于充满多孔珠层析柱的顶部。
由于大分子蛋白质不能进入层析珠内，因此它们被排出的时间比小分子短。
离子交换层析。
基于蛋白质净电荷差异进行的层析分离叫离子交换层析。
如果在中性pH值时蛋白质显正电荷，它们就会与表面带有羧酸根（阴离子）的层析介质珠结合。
那些带负电荷的蛋白质就不能与这种介质结合，直接从层析珠上流出（图3.4）。
逐步增加层析溶液的盐浓度。
层析溶液有更多游离的阳离子和阴离子。
这些游离离子与柱上固定离子竞争蛋白质。
那些正净电荷值低的蛋白质与层析柱的结合力弱，被首先洗脱出来；接下来是那些正电荷净值较高的蛋白质被洗出。
能够阴离子层析介质（羧甲基纤维素，CM-cellulose）柱纯化正电性蛋白质（阳离子蛋白质）。
相反，用带正电荷的层析介质（二乙胺乙基纤维素，DEAE-cellulose）柱层析纯化负电荷蛋白质（即阴离子蛋白质）。
图3.4离子交换层析。
该技术主要依据蛋白质净电荷差异进行分离。
亲和层析。
亲和层析是另一种有效的蛋白质纯化技术。
该技术利用蛋白质对特定化学基团的高度亲和性进行蛋白质纯化。
例如，共价连接了葡萄糖的层析柱能用来从植物抽提液纯化植物蛋白质刀豆素A（图3.5）。
因为刀豆素A与葡萄糖的亲和性很高，而其他蛋白质与葡萄糖的亲和性很低。
植物蛋白抽提液流过这样的层析柱，只有刀豆素A结合到层析柱上，其它蛋白质统统流出。
然后用含有葡萄糖的层析溶液将将刀豆素A洗出。
液相葡萄糖能替代固相葡萄糖，使刀豆素A从固相洗下（图3.5）。
亲和层析也是分离转录因子的有效技术。
转录因子能够与特定DNA序列结合，调节基因转录（39章和31章）。
蛋白质混合物流过共价交联了DNA的层析柱，那些与该DNA序列亲和性高的蛋白质组分将滞留在柱上。
然后用高浓度盐溶液将柱上结合的蛋白质洗出。
图3.5亲和层析。
用交联了葡萄糖（G）的固相载体亲和层析纯化刀豆素A（黄色）。
亲和层析纯化蛋白质的方法是
（1）先将蛋白质识别的基团X或者X的衍生物共价交联于固相载体上，然后将这种固相载体装入层析柱；
（2）将蛋白质混合物流过这种亲和柱，并用结合缓冲液洗涤除去不结合蛋白质；（3）用高浓度X溶液、或者用能够降低蛋白质与X亲和力的缓冲液洗柱，将目标蛋白质洗出。
如果蛋白质与X分子（即诱饵分子）相互作用具有高度特异性，那么亲和层析是一种非常有效地纯化蛋白质技术。
如果纯化重组蛋白质（5.2节），也可以更改上述的亲和纯化方案。
此时修改编码基因，使基因还编码一段额外的氨基酸序列，这段额外的氨基酸序列充当充当亲和层析标签用于亲和纯化。
例如，一串组氨酸（即His标签）可以添加到表达蛋白质的C-端或N-端。
有标签的蛋白质流过共价交联了Ni2+或其它金属离子的固相载体。
His标签与固相金属离子紧密结合，导致表达蛋白质也与载体紧密结合。
那些没有His标签的蛋白质不能与固相载体结合，直接从亲和柱流出。
加入咪唑或其它化学物质溶液，能够与金属离子结合从而将带有His标签的蛋白质洗出。
高压液相层析。
高压液相层析是上述柱层析技术的加强型。
层析柱的固相载体介质更细，因此与蛋白质相互作用的位点更多，分辨率更高。
由于载体介质更细，因此需要更大的压力才能获得足量的流速。
最终的结果是HPLC的分辨率高，分离所需的时间短（图3.6）。
图3.6高效液相层析（HPLC）。
HPLC进行凝胶过滤能够将下列蛋白质更好地分开。
这些蛋白质是
（1）thyroglobulin（甲状腺球蛋白，669kD）、
（2）catalase（过氧化氢酶，232kD）、（3）bovineserumalbumin（牛血清白蛋白，67kD）、（4）ovalbumin（卵白蛋白，43kD）、和（5）Ribonuclease（核酸酶13.4kD）。
凝胶电泳分离、显示蛋白质
怎样判断纯化方案有效？
一种方式是在每一个纯化步骤执行之后测定蛋白质的活性。
另一种方案是测定各个步骤纯化产物的蛋白条带数目，看蛋白质条带是否减少。
电泳技术使后一种检测方案成为可能。
凝胶电泳。
在电场中带有净电荷的蛋白质能够移动，这种现象叫电泳。
电泳是分离蛋白质及其它生物大分子如DNA和RNA的有效技术。
电场中蛋白质或其它分子的迁移速度（v）取决于电场强度（E），蛋白质的净电荷（z），和摩擦系数（f）。
ν=Ez/f
（1）
电力Ez驱使带电分子向相反的电极移动。
这种移动受到移动分子与介质之间的摩擦力f的阻滞。
摩擦系数f取决于迁移分子的质量和形状、以及介质的粘度。
对于半径为r的球状蛋白质而言，
f=6πηr
（2）
图3.7聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（A）凝胶电泳装置。
将蛋白样品加入平板凝胶的顶部上样孔中（每孔加样量是几微升）。
然后盖住电泳槽，接通电源电泳。
蛋白质与SDS形成复合物（带负电荷）就会向底部正极移动。
（B）多空凝胶的分子筛能够将蛋白质按大小分离开来，最小的分子移动最快。
电泳分离几乎总是在凝胶（或在固相载体如纸上）进行。
由于凝胶是多孔介质，因此有分子筛效应，能够促进电泳的分离效果（图3.7）。
比凝胶孔小的分子能跨过整个凝胶，比凝胶孔大得多的分子几乎不能泳动。
而分子大小居中的蛋白质则在凝胶中移动程度不同。
电泳的方向自顶部向底部。
电泳的固相介质是一个垂直的薄层聚丙烯酰胺凝胶。
选择聚丙烯酰胺凝胶的原因是
（1）化学惰性；和
（2）添加少量交联试剂就能使丙烯酰胺聚合成具有三维网状的凝胶（图3.8）。
电泳与凝胶过滤不同点在于，电泳时所有分子（无论大小）被迫穿过同一介质移动。
图3.8聚丙烯酰胺凝胶的形成。
活化单体（丙烯酰胺，蓝色）与交联剂（红色）共聚合形成三维网状结构。
在变性条件下，蛋白质凝胶电泳主要是依据分子质量差异进行分离。
蛋白质混合物先溶解在十二烷基硫酸钠溶液中。
十二烷基硫酸钠是阴离子型去污剂，能够破坏蛋白质分子中各种非共价键。
加入2-巯基乙醇或二巯基苏糖醇（DTT）能消除蛋白质的二硫键。
SDS阴离子与蛋白质结合按照一个SDS分子结合多肽链的2个氨基酸残基比例进行。
SDS与变性蛋白质形成的复合物的净电荷数量与蛋白质质量成正比。
因此与SDS结合后蛋白质复合物的负电荷数量远远大于天然蛋白质的净电荷数量（天然蛋白质净电荷数量效应可以忽略不计）。
然后在电场中电泳驱动蛋白质-SDS复合物移动。
当电泳完成后，用银或染料（如Coomassie蓝）染色能够观察蛋白质条带（图3.9）。
如果蛋白质分子已经被放射性同位素标记，可以将x-光片置于凝胶表面曝光探测，即放射性自显影。
图3.9电泳后染色蛋白质。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，蛋白质用Coomassieblue染色观察。
小蛋白质分子在凝胶中泳动快，大蛋白质分子泳动慢。
在这些条件下，大多数多肽链的迁移率与蛋白质质量的对数值成线性关系（图3.10）。
有些富含糖的蛋白质或膜蛋白不服从这个经验公式。
SDS-凝胶电泳（通常叫SDS-PAGE）速度快、灵敏度高、分辨率高。
用Coomassie蓝染色能检测出0.1μg的蛋白质条带，用银染色甚至能够检测出0.02μg以下的蛋白质条带。
分子质量差异只有2%的蛋白质（如50kD和51kD,长度只有10个氨基酸）就能用凝胶电泳区分。
用电泳检测我们能够确定纯化方案的效益。
起始组分将有几十甚至几百个蛋白质条带。
随着纯化操作的进行，蛋白质条带会消失，只有一条蛋白质条带强度逐步增加。
这个条带就是我们所需要的蛋白质条带。
图3.10电泳能够测定蛋白质分子质量。
很多蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳迁移率与蛋白分子质量的对数值负相关。
等电聚焦依据蛋白质酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基相对含量的差异也能将蛋白质分开。
蛋白质等电点（pI）是蛋白质分子净电荷为零时溶液的pH值。
此时，蛋白质在电场中不泳动。
例如细胞色素c的等电点是10.6，而血清白蛋白的等电点是4.8.。
无需SDS，直接用pH梯度凝胶电泳分离这些蛋白混合物。
每个蛋白质将移动到介质pH值等于自身pI值处。
依据蛋白质等电点分离蛋白质的方法叫等电聚焦（isoelectricfocusing）。
将具有不同等电点的两性电解质（聚合物）混合液加入凝胶，能够形成pH梯度。
等电聚焦电泳能够将pI值差异只有0.01%的蛋白质分开，即净电荷差异只有一个的蛋白质也能分开（图3.11）。
图3.11等电聚焦原理。
上样之前凝胶已经形成pH梯度。
（A）上样后，施加电压使带电离子泳动。
蛋白质会泳动至自身等电点，此时蛋白质没有净电荷。
（B）切下蛋白条带，用于后续实验。
二维电泳等电聚焦和SDS-PAGE结合能获得非常高的分辨效率。
样品先用等电聚焦分离，然后将一等电聚焦条水平放置于SDS-聚丙烯酰胺凝胶顶部，沿与聚焦条垂直的方向电泳，使蛋白质分布于二维面。
因此水平方向的电泳分离基础是是蛋白质等电点差异，垂直方向分离的基础是蛋白质质量的差异。
用二维电泳分离大肠杆菌蛋白质抽提液，一次能获得一千多个蛋白质凝胶电泳点（图3.12）。
图3.12二维凝胶电泳。
（A）蛋白样品先用等电聚焦电泳分离（方法与3.11相同）。
然后将等电聚焦后的凝胶置于SDS-凝胶顶部，沿原来分离方向垂直的方向进行电泳。
电泳分离的基础是蛋白质的分子量。
（B）用二维凝胶电泳分离大肠杆菌抽提液，能分离出一千多种蛋白质。
第一相是水平方向进行等电聚焦（根据等电点差异），第二相（垂直方向）进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（根据分子质量差异）。
可以用二维凝胶电泳分离不同生理状态细胞的蛋白质。
在应对细胞生理状态变化时，某一蛋白质含量会升高或降低。
我们怎样鉴定出应答这种变化的蛋白质呢？
尽管二维凝胶有很多蛋白质样品点，但是各个样品点的本质还不清楚。
将二维凝胶电泳与质谱分析技术相结合能够鉴定各个蛋白点的本质。
在3.5节我们将简单介绍这些技术。
蛋白纯化方案的定量评估
为了保证蛋白纯化方案是可行的，要测定每个纯化步骤纯化产物的比活性，并进行SDS-PAGE分析。
表3.1和图3.13列出了纯化一个虚构蛋白质各个步骤所获得的结果。
在纯化的每个步骤都要测定下列参数：
总蛋白：
从纯化液中取出一定体积溶液测定蛋白浓度，该浓度与溶液总体积的乘积就是溶液的总蛋白量。
总活性：
从纯化液中取出一定体积溶液测定蛋白活性，该活性数据与溶液总体积的乘积就是溶液的总蛋白活性。
比活性：
蛋白的总活性与总蛋白量的比值。
产率：
该参数用来衡量纯化操作保留了多少蛋白活性（与初抽提液相比）。
初抽提液活性定义为100%。
纯化水平：
每步纯化后蛋白质的比活性与初抽提液比活性的比值。
这个数值愈大表明蛋白质纯度愈高。
图3.13蛋白质纯化过程的电泳分析。
纯化方案见表3.1。
每个孔上样量是50ug。
与其它条带相比，目标条带愈来愈明显说明纯化是有效的。
如同我们在表3.1所看到的，第一步盐析导致蛋白质纯度只增加3倍，但是目标回收效率达到92%。
透析降低盐浓度后，将样品上样到离子交换柱，纯度达到9倍，但得率只有77%。
凝胶过滤层析是蛋白纯度达到110倍，但得率只有50%。
最后用酶的特异性配体进行亲和层析时蛋白纯度达到3000倍（与初抽提液相比），但得率只有35%。
图3.13是各纯化步产物的SDS-PAGE分析图谱。
随着纯化水平的提高，孔内的蛋白条带数目逐渐减少，而目标蛋白的含量逐渐增加。
好的纯化方案既要考虑纯化水平，又要考虑纯化的得率。
如果纯化水平高，但是样品得率很低，产生的蛋白量可能太少而无法进行后续试验。
得率很高但纯度不够又会造成样品杂质太多无法解释后续试验的结果。
超速离心是分离生物大分子和测定生物大分子质量的有用技术
前面说过，离心是分离细胞初抽提液的有效技术。
这里我们还要指出的是离心也是分离生物大分子、测定生物大分子质量的有效技术。
这个技术能够确定生物大分子的形状、密度、分子质量等参数，研究分子之间的相互作用。
为了从离心结果推出蛋白质的这些性质，我们要描述一个颗粒在离心力作用下的数学行为。
有离心力时一个颗粒将穿过液相介质。
定量该颗粒移动速率的方法是用下列公式计算沉降系数s：
s=m（1-νρ）/f
其中m是颗粒的质量，ν是颗粒的体积（根据颗粒的密度计算），ρ是离心介质的密度，f是摩擦系数（评价颗粒形状的参数）。
（1-νρ）就是离心介质施加给颗粒的浮力。
沉降系数单位是Svedberg单位（S），相当于10-13s。
S值愈小，在离心场移动愈慢。
表3.2和图3.14列出了一些生物分子和细胞组分的S值。
图3.14细胞组分的密度和沉降系数。
1.
一种颗粒的沉降速度部分取决于该颗粒的质量。
如果形状和密度相同，那么质量越大，颗粒的沉降速度愈快。
2.形状也影响沉降速度，因为颗粒的形状会影响颗粒沉降的粘度。
同样质量的颗粒，紧密压缩颗粒的摩擦系数比那些伸展颗粒的摩擦系数小。
因此球状颗粒的沉降速度比同质量长形颗粒的沉降速度快。
3.密度大的颗粒因为要克服的浮力（1-νρ）小，其沉降速度比密度小的颗粒快。
4.沉降速度也依赖于溶液的密度（ρ）。
当νρ<1颗粒沉降；当νρ>1颗粒上浮；当νρ=1颗粒不移动。
分带离心技术（也称梯度离心）能用来分离沉降系数不同的蛋白质。
第一步在离心管内建立密度梯度。
用梯度混合液注入20%~5%的蔗糖线性梯度溶液（图3.15），造成离心管底部蔗糖浓度是20%，顶部蔗糖浓度是5%的线性梯度。
浓度梯度的介质阻止了对流。
待分离的蛋白质溶液（小体积）置于密度梯度介质顶部。
当转子旋转，蛋白质依据其沉降系数通过梯度溶液。
根据经验确定离心的时间和离心的速度。
离心后在离心管底部刺出一个小洞，收集离心管内分离的各个条带。
然后测定各组分的蛋白质含量、酶的催化活性、或蛋白质的其它特性。
密度梯度离心技术可用来分离沉降系数差异达到2或2以上的蛋白质。
离心沉降平衡技术能直接用来测定蛋白质的分子量。
此时离心速度较慢使蛋白质沉降和蛋白质扩散达到平衡。
用离心沉降平衡技术测定的蛋白质质量非常准确，适于天然蛋白分子质量的测定。
这种条件能保留多亚基蛋白质天然的四级结构。
相反，在蛋白质变性条件进行的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳只能测定解离多肽链的质量。
如果我们既知道一个多聚体蛋白质沉降平衡离心的分子质量，又知道这个蛋白分子在变性条件下各组分的质量，我们就能够确定该多亚基蛋白各个多肽链的拷贝数。
图3.15区带离心。
操作步骤如下：
（A）形成密度梯度的离心介质，（B）将待分离样品置于梯度溶液的顶部，（C）将离心管置于悬挂式离心转子并离心，（D）收集样品。
3.2自动Edman降解测定氨基酸序列
当蛋白质被纯化后，就能用来测定蛋白质的氨基酸序列（或蛋白质一级结构）。
我们先考察一下如何确定一个简单多肽Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly的氨基酸序列。
第一步是确定多肽的氨基酸组成。
在6NHCl，110oC加热24小时将多肽断裂成氨基酸。
然后用离子交换层析对氨基酸进行分离，并根据洗脱体积确定各氨基酸组分（图3.16）。
除了脯氨酸外，用茚三酮处理氨基酸产生深蓝色。
由于脯氨酸含有二级胺，茚三酮处理产生黄色物质。
用茚三酮处理后，氨基酸浓度与溶液的光吸收成正比。
这种技术可以检测到1微克（10nmol）的氨基酸（相当于一个指纹所携带的氨基酸含量）。
用荧光胺代替茚三酮，可以测出出低至一奈克（10pmol）的氨基酸。
荧光胺与α-氨基反应能生成强荧光产物（图3.17）。
蛋白质水解产物的层析图谱与氨基酸标准的
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