奶粉中蛋白质含量实验方法.docx

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奶粉中蛋白质含量实验方法

【摘要】 目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。

方法使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用BCA（二喹啉甲酸）法，在570nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。

结果待测溶液中蛋白质浓度在0～250μg/ml范围内标准曲线呈线性关系，其回归方程为：

Y=301.12X-73.42，相关系数r=0.998，平均回收率为100.2%。

结论结合三氯乙酸沉淀的BCA法适用于奶粉中蛋白质的快速检验和掺伪检验。

【关键词】 奶粉；蛋白质；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺

Arapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilk

   ZhangZhiqiao,ShenGuodong,WangGang

   FirstMiddleSchoolofHefei,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001

　　［Abstract］Objective Toexplorearapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilkwithoutothernitrogen-containingcompounddisturbanceinKjeldahldetermination.Methods Conjugatedwithproteinprecipitationwithtrichloroaceticacid,BCA（bicinchoninicacid）methodwasused.Accordingtothepositiverelationshipofproteincontentwiththe570nmabsorbance,proteincontentwascalculatedinpowderedmilk.Results Proteincontentinmilksolutionshowedagoodlinearrelationshipatthedetectionrangesof0-250μg/ml,withregressionequation:

Y=301.12X-73.42andrelatedcoefficient:

0.998,andtheaveragerecoveryratewas100.2%.Conclusion BCAmethodconjugatedwithtrichloroaceticacidisadaptabletotherapidandsensitivedeterminationofproteininpowderedmilk.

　　［Keywords］Powderedmilk;Protein;BCAmethod;Trichloroaceticacid;Melamine

   蛋白质是人类最重要的营养物质之一。

因此，蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。

目前蛋白质定量方法较多,如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry法等。

虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。

为弥补这些不足，本实验利用BCA（二喹啉甲酸）法结合三氯乙酸沉淀法建立一种快速简便的测定奶粉中蛋白质含量的方法。

       1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　1.1.1 仪器

　　酶标仪（型号ELX800，BIO-TEKINSTRUMENTS公司），96孔微孔板，化学分析滤纸（直径：

9cm，最大孔径：

10μm，杭州新华纸业有限公司），玻璃漏斗、烧杯等。

　　1.1.2 试剂 

　　光明全脂速溶奶粉（黑龙江省光明松鹤乳品有限责任公司，产地：

齐齐哈尔，生产日期：

20081010），蒙牛学生多维高钙高锌奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，产地：

呼和浩特，生产日期：

20081207），尿素（分析纯，上海苏懿化学试剂有限公司），三聚氰胺（化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司），硝酸铵（分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司），三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），BSA（牛血清清蛋白，美国Sigma公司）BCA试剂盒（PIERCE公司，BCA23225），去离子水。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 方法原理 

　　据资料介绍，BCA法是目前已知的一种敏感准确的蛋白质测试法，广泛用于国内外企业和科研院所进行蛋白质含量检测。

其主要原理是：

要分析的蛋白质在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+，Cu+与BCA形成一种紫色化合物，其吸收峰在562nm波长处。

BCA法定量分析蛋白质具有准确灵敏（20～2000μg/ml）、快速（约40min）、稳定和经济实用（可以用试管或微孔板测定），以及它是反应物与蛋白质直接作用，对铵盐类等含氮化合物的抗干扰能力较强等特点。

　　三氯乙酸沉淀蛋白质的主要原理：

三氯乙酸作为蛋白质变性剂可使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水基团，使之聚集沉淀。

据文献报道，三氯乙酸比硫酸铜等物质能更好地排除非蛋白氮对溶液中蛋白氮的影响，具有广泛的适用性。

　　1.2.2 标准应用曲线的绘制 

　　配制2mg/ml牛血清清蛋白（BSA）溶液作为标准蛋白质储存液（含有9g/L氯化钠），参照BCA试剂盒说明书所示方法，按表1所示配制不同浓度BSA工作液，用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中200μl滤液加入等体积的10%三氯乙酸溶液，充分反应后12000r/min离心30min，吸取上清液待测；以9g/L氯化钠溶液为空白对照，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各25μl加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还加入200μlA液与B液（10A∶1B）的混合工作液，60℃水浴30min，用酶标仪在570nm波长下测定各个微孔中溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质质量浓度为横坐标，计算标准回归方程并绘制工作曲线。

表1 不同浓度BSA工作液的配方（略）

　　1.2.3 样品制备与测定 

　　准确称量牛奶粉150mg/份和300mg/份各4份，分别倒入贴有1、2、3、4、5、6、7、8标签的8个50ml离心管中，再分别称量20mg的硝酸铵、三聚氰胺和尿素各2份，按表2示倒入对应的离心管中。

加入适量60℃9g/L氯化钠溶液充分溶解，并用100ml容量瓶定容至刻度。

用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中200μl滤液加入等体积的10%三氯乙酸溶液，充分反应后12000r/min离心30min，吸取上清液待测；以9g/L氯化钠溶液为空白对照，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各25μl加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还加入200μlAB（10A∶1B）混合液，60℃水浴30min，用酶标仪在570nm波长下测定各个微孔中溶液的吸光度，从标准工作曲线上查出对应的蛋白质浓度。

表2 待测样品组成（略）

　　1.2.4 分析结果的表述与计算 

　　样品中蛋白质的含量X按式

（1）计算：

X=10C·F

（1），式中：

X-样品中蛋白质的含量，g/100ml（g），C-测定样品溶液中蛋白质含量（mg/ml），F-稀释倍数。

　　1.2.5 允许差 

　　同一样品的两次测定结果之差，不得超过平均值的51%。

　　2 结果

　　2.1 标准工作曲线及线性范围 

　　以BSA各级工作液的蛋白质浓度（Y，μgmoL-1）对其OD值（X）作图，结果表明蛋白质浓度在0～250μg/ml范围内标准工作曲线呈线性关系，标准曲线方程：

Y=301.12X-73.42，相关系数r=0.998。

见附图。

附图 蛋白质含量测定的标准曲线2.2 样品测定中干扰因素的影响 取上述添加了不同干扰物质的样品，按上述实验方法进行操作，结果发现，在60℃的水中三聚氰胺等添加物质都能充分溶解，只是过滤速度表现不一样：

添加了三聚氰胺的奶粉溶液过滤速度最快（3号和7号管分别用时为19min和21min），添加了尿素的奶粉溶液次之（4号和8号管分别用时为79min和92min），添加了硝酸铵的奶粉溶液最慢（2号和6号管分别用时为112min和124min）。

　　分别收集滤液和三氯乙酸沉淀后的上清液进行BCA法检测蛋白质含量，测得各项实验数据如表3。

结果发现三种不同的非蛋白质的含氮化合物基本不影响蛋白质含量的正确测定：

质量150mg的奶粉添加三种含氮化合物后平均蛋白质含量为35.72mg，标准方差为1.38mg；质量300mg的奶粉添加三种含氮化合物后平均蛋白质含量为62.13mg，标准方差为1.43mg；分别与空白对照的34.96mg和65.56mg，以及厂家奶粉中蛋白质标示量36mg和72mg相比，二者差异都不明显。

同时实验结果也表明本实验所用奶粉的蛋白质含量达到国家要求（我国《食品营养标签管理规范》的技术附件中规定，对于蛋白质和碳水化合物，其允许的误差范围是≥80%标示值）。

表3 不同样品蛋白质含量测定（略）

　　2.3 方法的加标回收率 

　　分别取奶粉1（光明全脂速溶奶粉，其稀释液为稀释液1）和奶粉2（蒙牛学生多维高钙高锌奶粉，其稀释液为稀释液2）加入60℃9g/L氯化钠溶液进行1/1000样品稀释，做方法加标回收试验，结果见表4，该方法的平均加标回收率为100.2%。

表4 方法的加标回收率

　　3 讨论

   奶粉中蛋白质含量是奶粉检验工作的一项重要指标。

目前国内主要采用常规凯氏定氮法，国外也多采用常规或改良的凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量，但此法费时、费水、费电，操作繁琐，试剂消耗量大，且不能有效区分非蛋白氮［2、3］。

常见的含氮化合物如硝酸铵和尿素比牛奶蛋白质的含氮率都高，易溶于水，很容易掺入奶粉等食物中；而三聚氰胺虽然常温和冷水状况下在水中的溶解度非常低［4］，但是人们平时习惯上和奶粉说明书上都要求用温开水冲调，例如60℃时三聚氰胺在100g水中可以溶解1.8g，100℃时溶解6.4g，因而掺伪问题容易受到人们的忽视。

   国内已有多篇文献涉及有关乳制品中蛋白质含量测定方法的研究，例如，云南工业大学张惠芬等探讨了在奶粉、豆奶粉、鱼粉中人为掺入尿素、硫酸铵等含氮化合物对蛋白质测定的影响，结果表明：

用95%乙醇能很好地将尿素与食品中蛋白进行分离，回收率较高，并能方便、快速测定掺入量。

对掺入硫酸铵等无机铵盐的测定，采用加MgO调到弱碱性，直接蒸馏测定［5］。

成都理工大学李海玲等通过对Lowry法、BCA法、磺基水杨酸沉淀法、Bradford法等4种常用蛋白浓度测定方法的研究认为，确定PEG-IL-6的最佳蛋白浓度测定方法为BCA法，而包涵体变性液中的蛋白浓度只能用Bradford法测定［6］。

中国农业大学食品科学与营养工程学院牛巍等利用三氯乙酸沉淀蛋白法和硫酸铜沉淀蛋白法对添加了非蛋白氮的液态奶进行蛋白氮测定。

结果表明，三氯乙酸沉淀法能更有效地排除非蛋白氮对液态奶蛋白氮测定的影响［7］。

河北省衡水市疾病预防控制中心田志梅等分别运用紫外分光光度法及甲醛值滴定法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量。

结果显示，两种方法均可有效解决非蛋白质类含氮物质对牛奶中蛋白质测定结果的干扰问题［8,9］。

中国农业大学侯彩云等使用三氯乙酸使蛋白质沉淀后，不同含量的蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不同的蓝紫色的络合物，根据其色度值与蛋白氮含量高低呈线性相关关系，用计算机软件自动分析获得的样品色度值，从而计算出蛋白氮含量［10］。

   综上所述，目前国内用于测定奶粉中蛋白质含量的方法有多种，其测定原理及结果的准确性各不相同，每种方法都有其优点及局限性。

相比较而言，本项目运用BCA法结合三氯乙酸沉淀蛋白法检测奶粉中蛋白质的含量，可以有效排除三聚氰胺等非蛋白氮的干扰，具有简便、快速、准确、实用的特点，可作为检测机构和平时人们准确检测蛋白质含量时考虑运用的方法之一。

奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。

因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。

本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。

摘要：

牛奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。

因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。

本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。

关键字：

牛奶  蛋白质钙铁锌

1、实验目的

用分光光度法测某牛奶中蛋白质、钙、铁、锌的含量。

2、实验原理

牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。

利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

双缩脲（NH2CONHCONH2）在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。

在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。

因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。

操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。

除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。

钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。

缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。

补钙越来越被人们所重视。

牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。

对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。

考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。

当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。

吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。

　　吸光度用A表示。

　　A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/（g·cm）,b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm，c为溶液浓度，单位g/L

　　影响吸光度的因数是b和c。

a是与溶质有关的一个常量。

此外，温度通过影响c，而影响A。

　　符号A，表示物质对光的吸收程度。

邻二氮菲也叫邻菲啰啉，是测定微量Fe2+的高灵敏度显色剂在pH2～9的条件下，Fe2+与邻二氮菲生成稳定的橙红色络合物，在510nm波长处有最大吸收。

测定时，控制溶液的酸度在pH＝5左右较为适宜。

酸度高时，反应进行较慢；酸度太低，则Fe2+离子水解，影响显色。

当铁浓度在5.0mg／mL以内时，吸光度与Fe2+浓度呈直线关系。

Bi3+、Cd3+、Hg9+、Ag+、Zn2+等离子在pH＝2~9时与邻二氮菲生成沉淀。

Co2+，Ni2+，Cu2+等离子可与邻二氮菲形成有色配合物，故应注意它们的干扰。

锌是人体中必需的微量元素之一，锌缺乏会阻碍生长发育，过量又会导致胃癌等疾病。

人类从牛奶等饮食中可以获得一定量的锌。

在pH4.0～5.5的水溶液中，锌离子与双硫腙（C13H12N4S）生成红色螯合物，摩尔吸光系数535=9.3×104L·mol-1·cm-1用四氯化碳萃取后比色定量。

在选定的pH条件下，用足够量的硫代硫酸钠可掩蔽水中存在的少量铅、铜、镉、钴、铋、镍、金、钯、银、亚锡等干扰金属离子。

3、实验步骤

3.1、试剂的配制

3.11、pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液的配制:

先配A液与B液。

A液：

0.2mol/L醋酸钠溶液。

B液：

0.2mol/L醋酸溶液。

取醋酸钠固体6.5461g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸5mL加水稀释至100ml，混合即得pH4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液200mL。

3.12、乙醇—乙醚混合液的配制：

取25ml95％乙醇与25ml无水乙醚混合

3.13、双缩脲试剂：

称取CuS04·5H2O0.3g，酒石酸钾0.9g和碘化钾0.5g，分别溶解后混匀，加6mol·L-1NaOH10mL，最后加水至100mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。

3.14、蛋白质标准液（10mg·mL-1），用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。

待测蛋白样本：

将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。

（如若不能溶解，滴加几滴6mol/LNaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容）

3.15、铁标准溶液（40.0µg·mL-1）：

:

准确称取0.0345g硫酸铁铵〔NH4Fe（SO4）2·12H2O〕于烧杯加入6mL6mol·L-1HCl和少量水，溶解后用纯水定容至10mL。

此溶液1.00mL含有40.0µg铁。

3.16、盐酸羟胺溶液（100g·L-1）：

:

称取10g盐酸羟胺（NH2OH·HCl），溶于水，并稀释至100m（新鲜配制，两周内有效）

3.17、邻二氮菲溶液（2g·L-1）:

：

称取0.20g邻二氮菲（C12H8N2·H2O），溶解于加有2滴浓盐酸的纯水，并稀释至100mL（新鲜配制，两周内有效）

3.18、醋酸钠溶液（1.0mol·L-1）：

:

称取8.2030g醋酸钠，用纯水溶解后稀释至100mL。

3.19、锌标准溶液（1.00µg·mL-1）：

准确称取0.0100g基准锌于100mL烧杯中，加入6mol·L-1HCl0.5mL，立即盖上表面皿，待锌完全溶解后，以少量水冲洗表面皿及烧杯壁，将溶液转入100mL容量瓶中，定容，即为锌标准贮备溶液。

准确移取1mL锌标准贮备溶液，稀释定容至100.0mL，即得1.00µg·mL-1锌标准溶液。

3.20、0.1％双硫酸腙四氯化碳贮备溶液：

称取0.10g双硫腙（C18H12N4S），在干燥的烧杯中用四氯化碳溶解后稀释至100mL，倒入棕色瓶中。

此溶液置冰箱内保存，可稳定数周。

3.21、双硫腙四氯化碳溶液：

临用前，吸取适量双硫腙四氯化碳贮备溶液，用四氯化碳稀释约30倍，至吸光度为0.4（波长535nm，1cm比色皿）。

3.22、25％硫代硫酸钠溶液：

称取64.60g硫代硫酸钠（Na2S203·5H20），溶于100mL纯水中。

3.23、1＋1氨水溶液:

10ml氨水加10ml水稀释

3.2、牛奶中酪蛋白的提取

3.21、酪蛋白的粗提

  50mL鲜牛奶加热至40℃。

在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液50mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。

离心15分钟（3000r·min-1）。

弃去清液，得酪蛋白粗制品。

3.22、酪蛋白的纯化

用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r·min-1），弃去上清液。

在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。

用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。

最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。

3.3、酪蛋白含量的测定

3.31、标准曲线的绘制与样品的测定

取试管8支，按下表操作。

各管混匀、放置37℃水浴中保温20min。

540nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。

3.32、计算

在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。

从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度（g／L），并求出牛奶中蛋白质浓度。

由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。

3.4钙含量的测定

3.41、钙制剂钙含量的测定

准确移取25ml的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

准确移取上述试液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5mol·L-1NaOH4mL，加入水20mL，摇匀，加铬蓝黑R8~10滴，用0.01mol·L-1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加2～3滴铬蓝黑，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（g/100mL），并与包装上注明的含量作比较。

3.42、注意事项

量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01mol·L-1EDTA体积为20~30mL。

牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加2～3滴指示剂。

3.5铁含量的测定

3.51、标准曲线的绘制

取25mL比色管6支，按下表顺序配制铁标准系列并记录测量的数据（注意：

加入盐酸钱干后需摇匀放置2min，再进行下一步操作），加完试剂后摇匀，放置37℃水浴中保温15min，以空白液为参比，在510nm下测定各溶液的吸光度值。

取25mL比色管2支，按照上表及上述方法测定510nm下的吸光度值。

3.52、计算

    在电脑上以吸光度值为纵坐标，以铁质量浓度（µg·mL）浓度为横坐标绘制标准曲线。

利用标准曲线计算鲜奶中铁的含量（mg/100mL）。

3.53、样品的测定

将50ml鲜奶一滴一滴加到热坩埚中避免沸腾蒸发。

除去水份后,强烈加热至450~550℃1小时。

冷却后,加1mL浓硝酸蒸发近干,重新在450~550℃灼烧（不能溅出）。

用少量稀硝酸溶解白色残液,转入10mL容量瓶中稀释至刻度,用稀氢氧化钠溶液调pH=7~8。

3.6锌含量的测定

3.61、标准曲线的绘制与样品的测定

  将70ml鲜奶一滴一滴加到热坩埚中避免沸腾蒸发。

除去水份后,强烈加热至450~550℃1小时。

冷却后,加1mL浓硝酸蒸发近干,重新在450~550℃灼烧（不能溅出）。

用少量稀硝酸溶解白色残液,转入10mL容量瓶中稀释至刻度,用稀氢氧化钠溶液调pH=7~8。

再用蒸馏水稀释到25ml.

可准确吸取1ml水样，用纯水稀释至10.0mL。

另取分液漏斗8个，依次加入锌标准溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00和5.00mL，各加纯水至10mL。

向水样与标准系列分液漏斗中各加1滴甲基红指示剂，用1＋1氨水调节溶液刚显黄色，再滴加乙酸溶液至红色（pH约4.4）。

加5mL四氯化碳，振摇萃取甲基红，弃去有机相。