肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制研究.docx

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肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制研究

肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制研究

叶惠芬刘朝晖周小棉陈惠玲赵祝香

【摘要】目的研究肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药机制。

方式采纳浓度梯度法（Etest）测定细菌对各类抗菌药物最低抑菌浓度，聚合酶链反映（PCR）扩增β内酰胺酶基因，并对扩增产物进行基因测序，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）进行外膜蛋白（OMP）分析。

用抑制实验进行主动外排机制检测。

结果4株菌株全数携带有SHV12型和DHA1型超广谱β内酰胺酶（ESBLs）基因，3株携带CTXM14型ESBLs基因；4株菌外膜蛋白分析发觉，肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药株与灵敏株相较，缺少分子量在32500～47500之间的一条带，从位置判定该条带可能为OMP36000或OMP37000的一种外膜蛋白；主动外排检测全数为阴性。

结论同时产多种β内酰胺酶归并外膜蛋白缺失可能是致使本组肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药的缘故。

【关键词】肺炎克雷伯菌；β内酰胺酶；外膜蛋白

ABSTRACTObjectiveToinvestigatethemechanismofKlebsiellapneumoniaeresistanttoimipenem.MethodsTheminimalinhibitiveconcentrations（MIC）oftheantimicrobialagentswasdeterminedbyEtest.Thegenescodedtheβlactamasewereamplifiedbypolymerasechainreaction（PCR）,andthesequenceswereanalyzed.Outermembraneproteins（OMPs）wereanalyzedbysodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis（SDSPAGE）.Reserpineinhibitiontestwasusedtostudytheactiveefflux.ResultsAllofthe4strainsofproducedSHV12andDHA1genotype.Theyalsoproducedotherβlactamase（CTXM14type,3isolates）.ComparedtoimipenemsensitiveisolatesbySDSPAGE,theimipenemresistantisolatesmarkedlylackedtheproteinbandofaboutwhichmightbetheoutermembraneproteinsofOmp36,000orOmp37,000accordingtotheelectrophoresismobility.Theactiveeffluxtestwasnegative.ConclusionKlebsiellapneumoniaeproducedmorethanoneβlactamaseandthelossofoutermembraneproteinsmaybeaccountedfortheoccurrenceofimipenemresistance.

KEYWORDSKlebsiellapneumoniae;βlactamase;Outermembraneprotein

肺炎克雷伯菌为临床感染常见病原菌之一，可引发肺炎、尿路感染、败血症、伤口感染、脑膜炎等多种疾病。

随着多重耐药菌株的日渐增多，医治该菌引发的感染变得愈来愈困难［1，2］。

亚胺培南是碳青霉烯类抗生素，其对革兰阴性菌产生的超广谱β内酰胺酶及AmpC酶都很稳固，因此临床上亚胺培南一直是医治革兰阴性菌感染的有效药物。

最近几年来，由于亚胺培南的普遍利用，国内外均发觉对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌，给医治带来诸多困难。

对亚胺培南耐药机制的研究和如何减少其耐药株的产生，已成为当前该领域最为关注的核心。

咱们对最近几年来在临床上分离的4株对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌进行研究，现报导如下。

1材料与方式

菌株来源

搜集我院住院感染患者送检痰样本中分离的亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌4株，其中从呼吸科和ICU病房分离各1株，神经科1株，干部病房1株，全数依照《全国临床查验操作规程》第二版常规培育分离；菌株采纳BioMerieux公司的VITEK2全自动鉴定系统鉴定。

药敏实验

采纳Etest法测定最低抑菌浓度（MIC），全数操作与结果判定均严格依照2005年美国临床实验室标准化研究所（CLSI）标准进行。

质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和产酶型大肠埃希菌ATCC35218。

ESBLs和AmpC酶检测

采纳酶提取物三维实验方式，依照文献［3］操作，以肺炎克雷伯菌ATCC700603和阴沟肠杆菌029M别离作为ESBLs和AmpC酶阳性质控菌株跟从实验。

实验所用药敏纸片和琼脂均为英国Oxoid公司产品。

细菌DNA的提取

将平皿上留宿培育的受试菌落接种于5mlLB肉汤中，37℃振荡培育12～16h后，13000r/min离心1min搜集沉淀（菌体）；采纳赛百盛（SBSGenetech）的硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒提取细菌质粒。

PCR扩增及序列分析

β内酰胺酶耐药基因所用引物参考文献报导［4，5］，包括TEM、SHV、CTXM1组、CTXM2组、CTXM9组、OXA、KPC、IMP、VIM、DHA和ACT1型耐药基因，均由上海英骏生物合成；所有PCR反映体系一致，25μl的PCR反映体系中含有10～100ngDNA模板，PremixTaqDNA聚合酶μl（所有PCR用的DNA酶、缓冲液、dNTP的2倍浓度的混合物，均购自大连宝生物工程），相应引物各25pmol；PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染液染色，用凝胶成像系统观看结果并照相。

所有PCR产物纯化后，由上海英骏生物采纳ABIPRISMB77测序仪进行序列分析。

外膜蛋白（OMP）分析

参考文献［6］方式并改良，将肺炎克雷伯菌接种于5mlLB培育液，置37℃恒温摇床孵育留宿，将菌液加入200mlLB液体培育基37℃恒温摇床继续培育5h后将培育物以4000r/min，4℃离心10min，弃上清，沉淀用50mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，悬浮于10mmol/LTrisHCl，冰浴条件下超声破碎细菌，每次2s，距离3s，共40个循环，将破碎菌液用4000r/min，4℃离心30min，以除去未破碎细菌，取上清液25000r/min4℃离心30min，弃上清，沉淀即为外膜蛋白，沉淀细菌膜用缓冲液从头悬浮，并在样品中加苯甲基磺酰氨（PMSF）。

外膜蛋白在电泳之前100℃加热5min，使蛋白质变性，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离外膜蛋白，凝胶浓度%，每点样糟加10μl样品，电压40v，当染料前沿进入分离胶以后，提高电压到100v，继续电泳，直至溴酚蓝染料抵达分离胶底部，电泳后用考马斯亮蓝R250染色30min，脱色留宿。

主动外排机制检测

参考文献［7］方式进行，配制2种MH平板，1种加入20μg/ml的利舍平，另1种不加利舍平，以观看利舍平对肺炎克雷伯菌是不是有抑制作用。

上述平板均涂布含×108CFU/ml的菌液，然后贴上亚胺培南Etest试条。

含利舍平组MIC为不含利舍平组的1/3或更低，抑制实验阳性，提示主动外排存在。

2结果

药敏结果

体外活性实验说明，4株肺炎克雷伯菌对阿米卡星、头孢吡肟、头孢噻肟、哌拉西林/三唑巴坦、头孢他啶、替卡西林/克拉维酸的MIC为256μg/ml，亚胺培南、环丙沙星MIC为32μg/ml，均为多重耐药。

耐药机制

4株亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌主动外排机制检测和ESBL、AmpC酶、β内酰胺酶基因检测、外膜蛋白表达情形见表1。

4株肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药性均较高，但在含利舍平的平板上，其MIC值没有明显下降，依照文献资料判定为主动外排机制阴性。

SDSPAGE进行外膜蛋白检测4株亚胺培南耐药株，加1株亚胺培表14株肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制检测结果-：

阴性；+：

阳性。

南灵敏株作对照检测，发觉耐药株全数在32500～47500分子量之间缺失一条带，从位置判定可能为OMP36000或OMP37000的一种外膜蛋白。

3讨论

肺炎克雷伯菌引发医院感染往往以耐药菌株为主，20世纪70年代流行耐庆大霉素的肺炎克雷伯菌，从20世纪80年代初发觉产ESBLs菌株以后，产ESBLs肺炎克雷伯菌的流行日趋严峻，呈世界范围散布，且有不断增加的趋势。

在所有β内酰胺类抗生素中碳青霉烯类具有最普遍的抗菌活性，是医治医院严峻感染经常使用药，尤其适用于产超广谱β内酰胺酶或（和）AmpC酶的肠杆菌科细菌的严峻感染，但随着碳青霉烯类抗生素在临床上利用增加，细菌也逐浙取得对此类药物的耐药性；临床上耐药多见于铜绿假单胞菌和不动杆菌属，在肠杆菌科中较少见。

本研究中4株肺炎克雷伯菌体外活性实验显示，其不但对亚胺培南耐药，对所检测的全数抗生素均耐药，呈现多重耐药，应引发咱们的高度重视。

肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素的要紧机制涉及产AmpC酶归并外膜蛋白的丢失、金属酶、OXA和KPC型β内酰胺酶等诸多方面；耐药质粒可在细菌间通过接合、转化、转导等形式产生传播，造成严峻的院内交叉感染和耐药菌的扩散；美国在几年前已有报导发觉产ACT1型β内酰胺酶归并外膜蛋白丢失、产KPC型酶的肺炎克雷伯菌，并曾在局部造成暴发流行［8］，我国浙江张幸国也曾报导发觉KPC2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，须引发足够的重视。

本研究未检出金属酶，也未检出主动外排机制。

PCR检测发觉4株全数携有SHV12型及DHA型ESBLs基因，3株携有CTXM14型ESBLs基因。

SDSPAGE观看到与亚按培南灵敏株相较，耐药株外膜蛋白在36000～37000分子量处缺失一条带，与国外报导相似［9］，考虑该4株菌对亚胺培南耐药可能与外膜蛋白缺失及归并产ESBLs或AmpC酶有关；因为外膜蛋白的缺失，可造成通透性的改变，而孔蛋白是抗生素或其它药物进入菌体发挥作用的要紧通道。

这4株菌来自不同科室，不同时刻，因此考虑属于散发，未显现暴发流行状况。

【参考文献】

［1］王文晶，黄茂，赵旺胜，等.下呼吸道感染产ESBLs肺炎克雷伯菌基因型分析［J］.中国感染与化疗杂志，2006，6（6）：

389～392.

［2］赵永新.下呼吸道感染病原菌的散布及耐药性的分析［J］.中国抗生素杂志，2006，31（3）：

190～192.

［3］叶惠芬，刘平，杨银梅，等.广州地域肠杆菌属高产AmpC酶和超广谱β内酰胺酶调查［J］.中国抗生素杂志，2004，29（10）：

601～602.

［4］WoodfordN,TieruoPMJr,YoungK,etal.OutbreakofKlebsiellapneumoniaeproducinganewcarbapenemhydrolyxingclassAβlactamase,KPC3,inaNewYorkmedicalcenter［J］.AntimicrobAgentsChemother,2004,48（12）:

4793～4799.

［5］王继东，钱小毛，糜祖煌，等.1株多重耐药肺炎克雷伯菌耐药基因和整合子、转座子遗传标记研究［J］.微生物与感染，2006，1（4）：

229～232.

［6］MasudaN,SakagawaE,OhyaS.OutermembraneproteinsresponsibleformultipledrugresistanceinPseudomonasaeruginosa［J］.AntimicrobAgentsChemother,1995,39（3）:

645～649.

［7］RiberaA,JuradoA,RuizJ,etal.InvitroactivityofclinafloxacinincomparisonwithotherquinolonesagainstStenotrophomonasmaltophiliaclinicalisolatesinthepresenceandabsenceofreserpine［J］.DiagnMicrobInfectDis,2002,42

（2）:

123～128.

［8］BratuS,LandmanD,HaagR,etal.RapidspreadofcarbapenemresistantKlebsiellapneumoniaeinNewYorkcity:

anewthreattoourantibioticarmamentarium［J］.ArchInternMed,2005,165（12）:

1430～1435.

［9］BradfordPA,UrbanC,MarianoN,etal.ImipenemresistanceinKlebsiellapneumoniaeisassociatedwiththecombinationofACT1,aplasmidmediatedAmpCbetalactamase,andthelossofanoutermembraneprotein［J］.AntimicrobAganteChemother,1997,41（3）:

563～569.