多粘类芽孢杆菌抗病作用综述.docx
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多粘类芽孢杆菌抗病作用综述
多粘类芽孢杆菌抗病作用综述
赵爽
多粘类芽孢杆菌是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，属于类芽孢杆菌属，1993年之前为芽孢杆菌属。
多粘类芽孢杆菌是一类对植物非致病性同时具有防病作用和促生作用的极富潜力的生防菌种，已被农业部列为免做安全鉴定的一级菌种（宋永燕，2006）。
多粘类芽孢杆菌能够作为一种生防菌种，首先在于这种细菌能产生多类抗菌物质，其中主要是肽类和蛋白酶类，也有关于多粘类芽孢杆菌产生激素类抗菌物质的报道。
另一方面，多粘类芽孢杆菌能够通过固氮和溶磷作用为植物提供养料（XuanT.H.,2004;KhanZ.,2007），促进植株生长，从而进一步起到抵抗各种病原微生物的效果。
植物促生长根围微生物（PGPR）是指在多种植物根部表面定殖并且能对植物造成明显好处的微生物。
PGPR能促进植物生长的原因有两个方面，直接原因在于分泌一些促生长物质，间接原因是PGPR能分泌多种抗生素抵抗有害微生物。
而作为PGPR，则不仅要有能在根部定殖的能力，还要能进行病害防治，促进植物生长。
研究表明多粘类芽孢杆菌有从土壤向植物根部移动定殖的能力（ChoiO.H.,2004），还可以作为多种植物病害的生防菌（HelbigJ.,2001;PerrinH,2002;JeonY.H.,2004;童蕴慧，2004；赵德立，2005），是一种很典型的PGPR。
人类的生存离不开粮食，目前，全世界的人口已经接近60亿，解决如此众多人口的吃饭问题就成为了农业工作者亟待解决的难题。
植物病害是严重影响农作物生产的主要原因之一，植物病害的流行必将给人类带来巨大的灾难。
植物病害对人类社会发展的影响是重大而多样的：
首先，植物病害必将造成产量的损失，严重时甚至绝产，最有名的是1845—1846年欧洲爆发的马铃薯晚疫病，仅在爱尔兰就有数十万人死于饥饿和营养不良，100多万人背井离乡逃亡美洲。
1943年孟加拉由于水稻胡麻斑病而使稻谷歉收，发生严重的饥荒，死亡200多万人。
其次，降低了产品质量，这在蔬菜和水果的生产上表现尤为突出，驰名中外的新疆哈密瓜受病毒侵染后，含糖量降低，品质恶劣（宗兆峰，康振生，2002）。
再次，植物病害还限制了作物在某些地区的种植，如荷兰榆病毁灭了美洲的榆树，栗疫病使得美洲栗在北美消失。
再者，人畜食用了某些发病的植物后会引起中毒，严重时会导致死亡。
此外，植物病害还会影响我国农产品的出口，我国加入WTO以后，不少国家为了限制我国农产品的流入而提高了产品质量及环境安全的标准，特别是近几年来，因为这方面的原因已给我国的农民造成了很大的经济损失。
因此，植物病害的防治一直是人们所关注的焦点。
人类对植物病害防治的认识经历了一个漫长的过程。
最初，人们认识到有害生物是造成植物减产的主要原因之一，消灭有害生物可以减少损失，因此单纯大量的使用化学农药，并且收到了很好的效果，这一时期也就成为了农药的黄金时代。
但是长期使用化学农药的弊端很快显现：
病原物产生抗药性；主要病害被控制后，次要病害迅速繁殖，上升为主要病害；原有的生态平衡被打破，生物链条紊乱；近几十年来，环境污染问题愈演愈烈，化学农药结构稳定，不易降解，土壤、水源中农药残留严重，直接危害人类的健康。
随着社会的进步，人类对自身健康和所生存的环境愈加关注，人们意识到单纯依靠化学农药不仅不能彻底消灭有害生物，还会对自身的生存造成危害。
因此，人们逐渐将经济效益、生态效益和社会效益统筹考虑，把有害生物的控制与维持自然生态的平衡密切结合起来提出了“有害生物综合治理”（IntegratedPestManagement，简称IPM）的概念，就是使用根据科学的植物保护原理将一系列多种措施（如生物防治、耕作防治、化学防治、害虫检测、经济阈值等方法）组合而成的一套病虫害防治战略战术。
它需要考虑有害生物的种群动态和其他生物（如天敌）以及治理措施对生态系统的影响，从而选择最有效的有害生物治理方法（张巨勇，2004）。
梅汝鸿（1996）指出植物病害防治经历了“已病治病”到“未病防病”的发展时期，当今微生态防治标志植物病害防治进入“无病保健”的一个新的历史发展阶段。
由于化学农药的种种弊端，目前更多的植保工作者都把目光投向了生物防治。
生物防治主要是运用自然界生物相生相克的原理，发挥病虫草害相克生物的作用，控制其危害，故具有较小的环境污染风险，是一种与环境友好的植保技术（杨怀文，2005）。
但就目前的情况来看，生物防治的效果还不及化学防治显著和快速，目前较理想的效果能达到60%-70%（陈利峰，徐敬友，2001）。
因此，发展生物防治是一条光明而漫长的道路。
古典的生物防治是指利用或引进一种无害生物以控制有害生物。
通过生态调节如引进以前没有的微生物以袭击有害生物，如害虫等，把用于防治害虫的生物称为天敌。
传统的生物防治概念是指，通过除人以外的一种或多种生物来降低一种病原菌数量或其治病活性。
广义的生物防治是指利用各种生物因素（除人外）来控制病害，也包括抗病育种、寄主植物抗病性的利用及有益生物代谢产物的利用。
狭义的植病生物防治仅是指利用拮抗性微生物防治植物病害。
我国对病害生物防治的提法是：
在农业生态系统中调节植物的微生物环境，使其不利于病原物或者使其对病原物与微生物的相互作用发生有利于寄主而不利于病原物的影响，从而达到防治病害的目的（鲁素云，1992）。
《植物病理学原理》中提到的植物病害生物防治的定义是利用其他对植物无害的有益微生物来影响或抑制病原菌的生存和活动，从而降低病害的发生率或严重度（宗兆峰，康振生，2002）。
我们在实践工作中经常涉及的植病生物防治的含义是指利用有益微生物，主要指细菌、放线菌和真菌等具有拮抗性的微生物来防治植物病害的各种措施。
目前，大多数生防菌来自于植物自然生态系中，特别是土壤，是生防菌的主要来源。
土壤中各种微生物含量丰富，通过土壤分离就可以得到具有拮抗作用的微生物。
但是这只是生物防治中所涉及的一部分，目前，人们对于植病生物防治的认识已从单纯依靠拮抗性微生物来控制病原物发展到借助于多种因素来创立一个有利于寄主而不利于病原物或病害发展的生物环境，以达到防治病害的目的。
1多粘类芽孢杆菌产生的抗菌活性物质
1.1肽类抗生素
多粘类芽孢杆菌产生的肽类抗生素按作用效果不同又可分为两类，一类是革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都有抑制作用的抗生素，这类肽类抗生素包括多黏菌素（polymyxin）；黏菌素（colistin）；环杆菌素（circulin）；多肽菌素（polypeptins）；paenibacillin和gavaserin，saltavidin。
而另一类是对真菌和革兰氏阳性细菌有活性的肽类，它们包括乔利肽菌素（jolipeptin）；谷缬菌素（gatavalin）;杀镰孢菌素（fusaricidins）等。
下面分别具体介绍这些肽类物质的结构及其部分性状。
1.1.1Polymyxin（Shojietal.,1977）
多黏菌素是由多粘类芽孢杆菌所产生的杂肽类抗生素，现今共发现有十四种不同的衍生物，它们共同的特点是分子中含有一个肽环（见图1，以组分A1为例），而根据肽分子线状末端所取代的基团和氨基酸组成不同分为A1、A2、B1、B2、D1、D2、E1、E2、F、M、P1、P2、S1和T1等14个组分。
DbuL-α、γ-二氨基丁酸
图1多黏菌素A1分子结构示意图
组分
分子式
备注
A1
A2
B1
B2
D1
D2
E1
E2
F
M
P1
P2
S1
T1
C53H100O13N16
C52H98O13N16
C56H98O13N16
C55H96O13N16
C49H92O14N16
C49H92O14N16
C53H100O13N16
——*
——
——
——
——
C58H91O15N15
C58H102O12N16
白色或无色粉末
——
碱性，白色粉末
碱性，白色粉末
碱性，白色粉末
碱性，白色粉末
——
——
有F1、F2、F3三个组分
——
由P.polymyxaT-39产生
由P.polymyxaT-39产生
白色无定形粉末，强碱性
白色无定形粉末，强碱性
*数据未给出
表1多黏菌素各组分分子式
1.1.2Colistin（Umezawaetal.,1978）
黏菌素分离出A、B、C三个组分（见图2）。
黏菌素分子中也含有一个肽环，组分C结构没有报道。
黏菌素具有良好的抗革兰氏阴性细菌活性。
其硫酸盐和甲磺酸钠盐在医学上有应用。
Dab：
α，γ-二氨基丁酰基
A：
MO=6-甲基辛酰基，B：
MO=异辛酰基
图2黏菌素结构示意图
1.1.3Circulin（Umezawaetal.,1978）
环杆菌素分子式为C53H100O16N13，结构式如下（图3），它与黏菌素A相似，区别仅在于肽环中用异亮氨酸代替了亮氨酸，它只有一种组分。
MO：
（+）-6-甲基辛酰基，Dab：
α，γ-二氨基丁酰基
图3环杆菌素结构示意图
1.1.4Polypeptins（DoiandMcGloughlin,1992）
多肽菌素同时具有抗细菌和真菌的作用，分子式为C56H96O13N12，具体结构式还未研究清楚。
盐酸水解后测定氨基酸组成为：
L-α、γ-二氨基丁酸 、L-亮氨酸、L-苏氨酸、D-缬氨酸、L-异亮氨酸、D-苯胺酸和未知酸C8H13O2。
1.1.5Paenibacillin
HeZ.G.（2007）发现的这种由多粘类芽孢杆菌所产生的新肽类抗生素分子量为2,983-Da，对革兰氏阳性细菌有很好的活性，能抑制包括芽孢杆菌属（Bacillusspp.）在内的食品微生物和腐生细菌。
并能与多黏菌素E1混合使用抑制产孢梭菌（Clostridiumsporogenes）、乳酸菌（Lactobacillusspp.）、肠膜状明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）、李司忒氏菌属（Listeriaspp.）、啤酒小球菌（Pediococcuscerevisiae）等多种细菌。
1.1.6Gavaserinandsaltavidin（BrigitteP.,1995）
这两种肽类抗生素都是多粘类芽孢杆菌在含有乳糖的培养基中产生的，都未报道分子式和结构，两种物质盐酸水解产物中都含有2,4-二氨基丁酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和色氨酸。
不同的是gavaserin中含有辛酸，而saltavidin中含有亮氨酸。
1.1.7Jolipeptin（ItoandKoyama,1972）
乔利肽菌素是一种无色结晶粉末状物质，盐酸水解产物及其比例为：
α、γ-二氨基丁酸：
丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸：
甘氨酸：
谷氨酸=2：
2：
2：
2：
1：
1。
对细菌有广谱抗菌活性，也对某些真菌抗菌作用。
1.1.8Gatavalin（Nakajimaetal.,1972）
谷缬菌素对革兰氏阳性细菌和分支杆菌、酵母、黑曲霉、苹果青霉、链孢霉等真菌有抑制活性。
水解产物含有谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸和缬氨酸。
1.1.9Fusaricidins（KajimuraandKaneda,1996）
杀镰孢菌素是由BacilluspolymyxaKT-8菌株产生的脂肽类抗生素，有A、B、C、D四种组分，结构式见图4。
也有报道多粘类芽孢杆菌其它菌株能产生杀镰孢菌素类似物，其分子量分别为883,897,948和961Da，但未给出具体结构（PerrinH,2002）。
AR1=—CH2CONH2，R2=—CHMe2
BR1=—（CH2）2CONH2，R2=—CHMe2
CR1=—CH2CONH2，R2=—CH2C6H4—OH（4）
DR1=—（CH2）CONH2，R2=—CH2C6H4—OH（4）
图4杀镰孢菌素结构示意图
1.2蛋白类
多粘类芽孢杆菌还能产生多种抑菌蛋白及蛋白酶，这些蛋白类抗菌物质通常只给出了分子量及部分性质，立体结构及氨基酸一级结构还需进一步的研究。
Saravanakumar（2005）报道过一株多粘类芽孢杆菌VLB16所产生的蛋白能够抑制稻瘟菌（Pyriculariagrisea）和水稻纹枯病菌（Rhizoctoniasolani），显微观测发现它能抑制真菌器官形成时的细胞转化过程。
其分子量为37KDa并且能耐121℃的高温。
陈雪丽等（2007）从多粘类芽孢杆菌BRF-1发酵液中得到一种对大豆立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）具有拮抗活性的抗菌蛋白，分子量约35.4kD。
宋永燕（2006）报道了从多粘类芽孢杆菌产生的抗菌蛋白对辣椒炭疽病菌（Coooetotrichumgloeosporioides）等多种植物病原真菌有强烈的抑制作用。
其对链霉蛋白酶E和胰蛋白酶不敏感，对蛋白酶K部分敏感；对热稳定；酸碱处理发现抗菌蛋白在pH8.5时最为稳定，而在pH2.5时80℃处理1h完全失活；25W紫外灯（2400lx）照射8h对其活性没有影响。
发酵上清液经硫酸铵盐析、高温（100℃）处理和SDS-PAGE分析，该抗菌蛋白的分子量介于6kDa和14.2kDa之间。
多粘类芽孢杆菌产生的蛋白酶的分子量从10KDa到37KDa不等。
这些蛋白中，有的是能降解革兰氏阳性细菌细胞壁葡聚糖的β-1，3-1，4-葡聚糖酶类似物（姚乌兰,2004）；有的是能降解真菌细胞壁的几丁质酶（Mavinguietal.,1994;Jungetal.,2002）；还有的菌株还能产生水解酶（NielsenandSorensen,1997）；最近ChoK.M.（2006）等还发现一株内生多粘类芽孢杆菌GS01的CEL44C-MAN26A基因能编码一种具有糖基水解酶活性的蛋白，对纤维素、木聚糖、苔聚糖、甘露聚糖等多种糖类都有水解活性。
以上这些酶类的发现都大大丰富了多粘类芽孢杆菌的利用领域。
1.3核苷类polyxin（Piurietal.,1998）；
多氧霉素是一类核苷抗真菌抗生素，其分子式及结构如下，根据R1、R2、R3三个取代基的不同被分为11个组分（表1）。
图5多氧霉素结构示意图
组分分子式取代基
R1R2R3
AC23H32O14N6CH2OH
OH
BC17H25O13N5CH2OHHOOH
DC17H23O14N5COOHHOOH
EC17H23O13N5COOHHOH
FC23H30O15N6COOH
OH
GC17H25O12N5CH2OHHOH
HC23H32O13N6CH3
OH
JC17H25O12N5CH3HOOH
KC22H30O13N6H
OH
LC16H23O12N5HHOOH
MC16H23O11N5HHOH
表1多氧霉素各组分分子式及取代基团
1.4其他
除以上产物外，多粘类芽孢杆菌还能产生细菌素类抗生素（SvetochE.A.,2005）、吡嗪代谢物2,5-diisopropylpyrazine（BeckH.C.,2003）、激素类，如：
生长素和细胞分裂素（TimmuskS.,1999）、酚类化合物（Lebuhnetal.,1997）等多种活性产物。
2多粘类芽孢杆菌防病机理
多粘类芽孢杆菌作用范围广，能对病原细菌、病原真菌、根结线虫（KhanZ.,2007）等多种有害微生物进行防治。
其作用机理多样。
既有抗菌物质起作用，又有可能是细菌菌体直接起作用（DijksterhuisJ.,1999），还有可能是与植物互作而加强植物抗病性（赵继红，2003）。
2.1直接防病机制
2.1.1作用于细菌细胞膜
多黏菌素的作用位点为细菌的细胞膜，多黏菌素分子中的环状结构能插入细菌细胞膜从而改变细菌细胞膜的渗透性，造成细菌内含物的流失，最终导致细菌死亡（FredC.，2006）。
ClausellA.等人（2007）对多黏菌素B的进一步研究表明，多黏菌素B能够同时作用于细菌细胞的外膜和内膜，通过对两层膜之间的磷脂交换起干扰使得细胞膜的渗透压不稳定，从而杀死细胞。
他们还发现了多黏菌素的活性强弱取决于其分子本身双亲性的大小。
除polymyxin外，colistin；circulin和gavaserin，saltavidin等抗菌物质都对细菌有抑制作用，而对真菌无效，加上他们的分子结构和组成都与多黏菌素相似，笔者推测这些抗菌物质的作用位点很可能都是细菌的细胞膜。
2.1.2作用于真菌细胞壁
核苷类抗菌素多氧霉素能作用于病原真菌细胞壁。
Endo等（1970），Bartnicki-Garcia等（1972），Bowers等（1974），Ishizaki（1974）等都先后报道过多氧霉素能引起真菌生长时的菌丝尖端形成膨胀泡而破裂。
Ohta等（1970）对14C-葡萄糖胺掺入植物病原菌水稻旋孢腔菌（Cochliobolusmiyabeanus）的细胞壁几丁质中的过程研究发现，加入多氧霉素后能够抑制这一过程。
Endo和Misato（1969）报道多氧霉素D（结构见图5A）抑制由几丁质合成酶催化的，由UDP-N-乙酰葡萄糖胺（结构见图5B）到几丁质这一步反应，并通过酶的动力学研究，说明多氧霉素D是几丁质合成酶的竞争性抑制剂（见图6）。
多氧霉素D与几丁质合成酶的底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺结构类似，从而竞争性地抑制该酶活性，导致真菌细胞几丁质不能合成而起到杀菌作用（Horietal.,1974）。
A
B
图5UDP-N-乙酰葡萄糖胺（A）和多氧霉素D（B）的化学结构式
图6多氧霉素作用位点示意图
2.1.3菌体直接起作用
DijksterhuisJ.（1999）发现在镰刀菌（Fusariumoxysporum）液体培养基中加入多粘类芽孢杆菌无菌滤液对镰刀菌无作用，而加入活菌体则能大大抑制镰刀菌的生长。
这说明这株多粘类芽孢杆菌对镰刀菌的抑制是活菌体直接起抑制作用。
2.2间接防病机制
2.2.1诱导作用
多粘类芽孢杆菌不仅能直接杀死病原菌，还能通过与植物之间的互作来起到抗病效果。
诱导植物系统抗性是植物被环境中的非生物或生物因子激活产生的对随后的病原菌侵染具有抵抗性的特征。
系统抗性的诱导可以使与植物防卫有关的病程相关蛋白（PR-蛋白）的活性增加；也会导致一些低分子量的微生物拮抗物质,如植保素的积累；还会形成其他保护作用的生物大分子，如：
木质素、β-D（1,3）-葡聚糖和富含羟脯氨酸的糖蛋白等。
植物被诱导系统抗性后，便具有广谱抗性（赵继红，2003）。
国内有研究发现拮抗细菌多粘类芽孢杆菌W3菌株悬浮液及其滤液都可以诱导番茄叶片对灰霉病（Botrytiscinerea）的系统抗性。
W3及其滤液诱导处理后，植株叶内苯丙氨酸解氨酶（PAD）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）活性明显增强（童蕴慧，2004）。
这表明该拮抗细菌诱导的系统抗性可能与水杨酸介导有关。
国外则报道了接种PGPR对植物基因表达的改变。
他们用拟南芥作为模式植物，接种多粘类芽孢杆菌。
结果发现：
ERD15这个基因以前被认为是干旱胁迫反应的基因。
对接种多粘菌有表达（TimmuskS.,1999）。
这说明，生物胁迫和非生物胁迫对植物基因表达有时起着相同的作用。
这也为我们利用多粘类芽孢杆菌作为生防微生物提供了新的方向和思路。
2.2.2提供营养
有些多粘类芽孢杆菌能够通过固氮和溶磷为植物提供植物自身难以吸收的氮源和磷肥养料。
多粘类芽孢杆菌能在植物根尖定植并形成生物膜，并且在根部维管柱外的细胞内空间积累，但没有发生系统扩展（TimmuskS.,2006），产生的生物膜能够大大加速植物吸收营养物质的过程。
在印度大豆田做的实验发现，在单独或同时接种了慢生大豆根瘤菌和PSB（磷溶细菌）多粘类芽孢杆菌后的大豆，在产量和质量上都有很大的提高，在磷肥施用量在19.65kg每公顷时，同时接种生大豆根瘤菌和多粘类芽孢杆菌能得到最高的种子产量、油产量及蛋白含量（JainPC.,2005）。
El-NagarGR（2002）在埃及做的大田试验发现，在接种了多粘类芽孢杆菌的小扁豆田中，植株重量、分支数、干重、千粒豆子重量、蛋白含量及豆子磷含量百分数与对照相比都有很显著的提高，在同时接种根瘤菌、多粘类芽孢杆菌和加入15kg氮肥的田地中，小扁豆有最高的种子产量、氮肥重复利用率及豆子含磷百分数，分别为802.81kg/fedden、28.08kg/fedden和1.06%。
3展望
多粘类芽孢杆菌能分泌多种胞外抗菌物质，对多种病原菌有抑菌活性，是一种很好的生防菌株。
前人对多粘类芽孢杆菌产生的抗菌物质已经进行了较深入的研究，揭示和发现了多粘类芽孢杆菌所产生的各种抗菌物质。
随着新技术的不断发展，笔者相信不久将来，多粘类芽孢杆菌抗菌物质的应用将会越来越广泛。
多粘类芽孢杆菌所产生的抗菌蛋白与抗病基因的联系，开发生物农药以及基因工程菌株的构建将成为多粘类芽孢杆菌研究的热点。
参考文献
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