干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定.docx

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定.docx

《干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定.docx（6页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

【摘要】　　目的：

利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）表达的载体，并进行活性鉴定。

方法：

设计表达短发夹RNA的互补DNA序列，经退火成双链，克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中，构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5α菌株，扩增，提取质粒，酶切鉴定后测序分析。

构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞，检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化，确定重组质粒的活性。

结果：

构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2。

酶切鉴定和测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致，经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。

重组质粒有效转染HepG2细胞并显着抑制AFP表达。

结论：

成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体。

【关键词】AFP蛋白　RNAi　shRNA　重组质粒载体

AbstractObjective：

ToconstructtherecombinantplasmidexpressingtwoAFP-targetedshorthairpinRNA（shRNA）withpGenesil-1plasmidsvector,andDetecttheActivityofRecombinantPlasmidinHepG2cells.Methods：

TwopairsofDNAsequencesweredesignedandsynthesized,andformedcomplementarychainsbyannealingrespectively.Thentheobtainedproducts,siAFP1andsiAFP2,wereinsertedintoplasmidvectorpGenesil-1withU6promoter.TherecombinantplasmidsweretransformingintotheEscherichiacolistrainDH5αforscreeningandamplifying.ThesequenceanalysisoftheplasmidsandidentifiedbySalIdigestionwascarriedout.ThebiologicalactivityofrecombinantplasmidwasdetectedbytransfectingintotheHepG2cellline.Results：

ThetwoAFP-targetedshRNAsexpressingframeweresuccessfullyinsertedintothepGensil-1plasmidvectorrespectively,andtheobtainedshRNAscodingsequenceswereconsistentwiththedesignedfragments.TherecombinantplasmidinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2：

TheconstructionoftworecombinantplasmidsofAFP-targetedshRNAwassuccessful.TworecombinantplasmidsexpressingAFP-targetedshRNAinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2cells.

KeyWordsAFP；RNAinterference；ShorthairpinRNA；HepG2cells

长期以来，人们只是把AFP作为一个肿瘤标志物，用于原发性肝癌（HCC）的诊断指标之一。

诸多研究关注于检测甲胎蛋白对原发性肝癌诊断运用，而对AFP和肿瘤细胞发生及增殖的关系并不完全清楚［１～3］。

近年发展起来的RNA干扰技术为探索AFP的生物学功能提供了有力的工具。

RNAi技术是通过导入细胞19nt～23nt的小分子干扰RNA（smallinterferenceRNA,siRNA），降解同源mRNA，高效、特异性阻断目的基因表达［４～7］。

本研究针对人AFP基因设计了2个位点的shRNA表达序列，用人U6启动子和RNApolymeraseⅢ（PolⅢ）终止信号，构建针对AFP的特异性shRNA真核表达载体，并转染HepG2细胞鉴定活性，探索RNAi技术在沉默AFP基因中的作用。

1材料和方法

　材料

质粒载体pGensil-1（含有EGFP，kanar，Neor表达框架和U6启动子），Escherichiacoli感受态菌株DH5α均由武汉晶赛生物公司提供；质粒抽提试剂盒由中鼎公司提供；DNA连接酶和核酸内切酶：

T4DNALigase，SalⅠ，BamHⅠ，HindⅢ以及DL2000Marker均由美国NEB公司提供；人肝癌细胞HepG2株，由北京大学医学部感染科病毒研究室惠赠；阳离子脂质体METAFECTENE由德国BIONTEX提供。

AFP微粒子化学发光免疫分析试剂盒由美国BECKMEN公司提供。

　方法

　靶向AFPRNAi位点筛选及表达shRNA序列的设计：

根据GenBank中人肝癌细胞HepG2细胞AFP基因的核苷酸序列，参考siRNA的设计策略，分别设计两条表达shRNA的寡核苷酸序列，siAFP1，siAFP2以及通用阴性对照siHK。

经Blast软件查对及序列同源性分析，确定目标基因序列。

表达shRNA的寡核苷酸结构

以上序列送武汉伯杰生物技术公司合成。

　表达质粒的线性化：

pGenesil-1质粒用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，37℃酶切8h，10　g/LAgarose凝胶电泳分别回收大片段，即为线性化表达质粒。

　重组质粒的构建、酶切鉴定和测序：

分别用annealingbuffer50μL溶解上述单链寡核苷酸片段。

各取2μL+annealingbuffer16μL混匀。

94℃退火5min，自然冷却至室温，得到退火产物siAFP1和siAFP2双链。

各取退火产物1μL加H2O99μL稀释100倍。

稀释的退火产物siAFP1和siAFP2分别与线性化质粒pGenesil-1用T4DNALigase，10×LigaseBuffer进行连接，22℃水浴反应过夜。

连接产物分别命名为pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2。

各取过夜连接产物5μL转化感受态DH5а，分别涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。

从每个培养皿上随机挑取3个单菌落接种于3mL含Kanar抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜。

用质粒提取试剂盒小量提取质粒，并分别做酶切鉴定：

重组质粒　μL用SalⅠ　μL，10×LBuffer1μL做酶切，37℃水浴反应3h，10g/LAgarose凝胶电泳鉴定。

挑取克隆正确的重组质粒转化菌液去测序。

通用阴性对照pGenesil-1-siHK的连接鉴定亦如上述。

　重组质粒活性鉴定：

以阳离子脂质体METAFECTENE与重组质粒的比例为8μL∶μg分别转染HepG2细胞。

24h后，采用微粒子化学发光免疫分析法，检测转染组和对照组的细胞培养上清液中AFP含量，确定shRNA表达载体活性。

荧光显微镜检查爬片细胞，计数发荧光细胞占总细胞的比率，确定转染率。

2结果

　重组质粒的酶切鉴定

因为pGenesil-1-siAFP1、pGenesil-1-siAFP2和pGenesil-1-siHK分别含两个SalI酶切位点，所以重组质粒能够被SalI酶切出包括插入序列和U6启动子在内的一条302bp的DNA片段，表明目的序列siAFP1、siAFP2和siHK已经分别插入pGenesil-1质粒载体。

　重组质粒测序分析

经测序结果分析pGenesil-1-siAFP1,pGenesil-1-siAFP2和pGenesil-1-siHK均为插入正确的克隆质粒，而且质量均符合设计标准。

　重组质粒的活性鉴定

重组质粒经脂质体转染HepG2细胞24h后，在荧光显微镜下，有EGFP报告基因表达蛋白的细胞发绿色荧光，转染率达%。

细胞培养上清液的AFP检测：

转染pGenesil-1-siAFP1的细胞为（±）μg/mL，转染pGenesil-1-siAFP2细胞为（±）μg/mL，而转染pGenesil-1-siHK的细胞为（±）μg/mL，方差分析显示三组细胞培养上清液的AFP含量具有显着差异，pGenesil-1-siAFP1的抑制AFP基因表达的作用胜过pGenesil-1-siAFP2（t=,P＜）。

　　3讨论

AFP是胚胎期肝细胞和卵巢黄囊产生的一种蛋白，它是啮齿类动物胚胎期和人胚胎期血清中的主要蛋白成分。

早在1944年已有人对甲胎蛋白的存在进行过研究，直到1965年美国科学家Bergstyandh和Czar才观察到AFP是原发性肝癌患者血清中存在的一种特殊的蛋白成分。

认为它不仅在胎儿时期产生，原发性肝癌细胞也大量分泌这种蛋白质。

1998年ElenaDudich等通过体外实验研究注意到，AFP对肝癌细胞生长的调节有双相效应性，即低含量的AFP，特别是当有其他细胞因子存在时，AFP能促进细胞增殖，但大剂量AFP时，则可诱导细胞凋亡［８］。

进一步研究发现，在肝癌细胞膜上有两种不同亲和参数的AFP受体存在，并证明人肝癌Bel7402细胞能分泌AFP，且AFP能作用于细胞膜上的AFP受体，因而认为AFP可能是重要的内源性促肿瘤细胞增殖的自分泌性蛋白质［９］。

另有研究表明，AFP对Hela细胞的生长也有促进作用，经使用与AFP分子结构相似的白蛋白作对照，结果发现HAS对Hela细胞的增殖、细胞内信号和基因表达均没有影响，而抗AFP单克隆抗体能有效地阻断AFP的这一作用。

提示AFP促进Hela细胞增殖具有高度特异性，影响AFP的分泌可能影响肿瘤细胞的增殖和生长［１０］。

AFP在原发性肝癌时表达增强，并通过与相应受体结合，对肿瘤细胞的增殖起促进作用。

而且阻止AFP与其相应受体结合及干扰和影响AFP基因表达技术和方法都有可能成为抗原发性肝癌的新的治疗策略。

有关肿瘤的基因治疗一直是人们普遍关注的研究领域，为干扰和抑制肿瘤细胞的蛋白合成，曾进行过反义RNA、核酶技术、细胞自杀基因导入等方面的实验研究。

而近年来发现的RNA干扰技术被认为是最有效基因敲除方法。

选择与靶mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（dsRNA）导入细胞，可以使靶mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默,被称为转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）。

这种转录后基因沉默与传统的基因敲除技术相比，具有投入少，周期短，操作简单等优势。

Shlomai等［１１］针对靶基因HBV-X，HBV-Core已成功构建了siRNA表达质粒Psuper-x和Psuper-core，使其转染HBV感染细胞，获得显着且特异性地降低X蛋白和核心蛋白的表达水平的结果。

Randall［１２］针对靶基因NS5B，体外转录合成21nts的siRNA，转染Huh-7细胞，使HCV-RNA的表达率下降80倍。

这些实验研究均为RNAi沉默外源性基因例子。

而Jurgensoutschek等［１３］研究证明siRNA也能使内源性基因沉默，他们合成针对apoB的siRNA，能特异性的使apoB蛋白水平下降，从而使血清胆固醇水平下降，同时证实siRNA能使转基因小鼠体内apoB基因沉默。

RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能的重要工具［14］。

本实验通过构建AFPshRNA载体质粒并成功转染细胞，有效抑制了AFPmRNA的表达，为进一步研究AFP基因在疾病中的作用以及探索肝脏肿瘤的基因治疗奠定基础。

【参考文献】

　　［１］MasscffCilliJ,krebs　ofalpha-fetoprotein（AFP）serumlevelsduringlifespaninmanandrat.AnnNYAcaSci,1975,259

（1）:

17～28.

［２］吴雪辉,李穗芬,石亚玲.电化学发光免疫分析法在AFP定量检测中的应用.标记免疫分析与临床，2003,10（4）:

232～234.

［３］章秀兰．用检测甲胎蛋白的定性ELISA试剂作定量测定的尝试．上海医学检验杂志，2002,17（4）:

154～256.

［４］Hannon　，2002，418:

244～251.

［５］DonzeO,PicardD.RNAinterferenceinmammaliancellsusingsiRNAssynthesizedwithT7RNApolymerase.NucleicAcidsRes，2002：

30:

e46.

［６］YuJY,DeRuiterSL,TurnerDL.RNAinterferencebyexpressionofshort-interferingRNAsandhairpinRNAsinmammaliancells.ProcNatlAcadSciUSA，2002，99:

6　047～6　052.

［７］MiyagishiM,TairaK.U6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3‘overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatBiotechnol，2002，20:

497～500.

［８］ElenaDudich,LydiaSemenkova,ElenaGorbatova,etal.Growth-RegulativeActivityofHumanAlpha-FetoproteinforDifferentTypesofTumorandNormalCells［Ｊ］.TumorBiology，1998,19

（1）:

30～40.

［９］UrielJ,Thephysiologicalroleofalpha-fetoproteininCellgrowthanddifferentiation［Ｊ］.Nucl.Med.AlliedSci,1989,33:

12～17.

［１０］LiMS,LiPF,HeSP,et　molecularmechanismofalpha-fetoproteinonthegrowthofhumanhepatomaBel7402linecells［Ｊ］.WorldGastrunal，2002,8（3）:

467～472.

［１１］ShlomaiA,Shaul　ofhepatitisBvirusexpressionandreplicationbyRNAinterference［Ｊ］.Hepatology,2003,37（4）:

764～770.

［１２］RandallG,GrakouiA,Rice　ofreplicatinghepatitisCvirusrepliconRNAsincellculturebysmallinterferingRNAs，2003,100

（1）:

235～240.

［１３］SoutschekJ,Akinc　silencingofanendogenousgenebysystemicadministrationofmodifidedsiRNAs.Nature，2004，432：

173～177.

［１４］TuschT.,ZamoreP.,LehmannR.,et　mRNAdegradationbydouble-strandedRNAinvitro.［Ｊ］Genes&Dev，1999,13:

3　191～3　197.