可用来交论文生命科学进展综述反义RNA技术与RNA干扰技术.docx
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可用来交论文生命科学进展综述反义RNA技术与RNA干扰技术
反义RNA技术与RNA干扰技术
摘要：
RNA是生物体内最重要的物质基础之一,它与DNA和蛋白质一起构成了生命的框架。
因其能干涉哺乳动物基因表达而颇受瞩目,并且由此而引发的RNA干涉（RNAi）成为了当前分子生物学和细胞生物学最为热门的话题之一。
RNA干扰技术在2002年被Science杂志评为年度十大科技成就之首，而反义RNA技术的发现对现代医疗技术的发展也起着重要的作用.常规的反义RNA技术是设计出与靶RNA互补的寡核苷酸,通过它与靶RNA结合来干扰转录或翻译过程,使蛋白质不能被表达出来。
本文通过对热点的RNA干扰技术以及反义RNA技术的生物学特性，分子机制，产生方法，和应用以及展望等方面的介绍，在对比中得出该两种技术的异同点，从而使对以RNA干扰和反义RNA为代表的RNA技术有更深入的了解。
关键词：
反义RNA技术，RNA干扰技术，生物学特性，分子机制，产生方法，应用,展望
AntisenceRNATechniqueandRNAiTechnique
Abstract：
RNAisoneofthemostessentialfundamentalsubstances,togetherwithDNAandprotein;itformstheframeoflife.RNAhasbeenmuchfixedeyeonbythereasonthatitcaninterfereinthegeneexpressionofmammals,whichleadstheRNAitobeoneofthemostheatedtopicsinmolecularbiologyandcytobiolog.WiththeRNAitechniqueregardedthefirstofthetop10scienceandtechnologyachievementsbyScience,thediscoveryofantisenceRNAtechniqueplaysanirreplaceableroleinthedevelopmentofmedicaltechniques.TheregularantisenceRNAtechniquedesignstheoligonucleotidewhichcausesacomplementationwiththetargetRNA,byitscombinationwithtargetRNA,itinterferesthetranslationoftranscriptionandtranslation,thusmakingitincapableforproteintoexpress.Thisarticleintroducesthebiologicalcharacteristics,moleculemechanisms,preparation,applicationandfutureofboththeantisenceRNAtechniqueandRNAitechnique.Withthecontradistinctionofthesetwotechniques,wecangetabetterandcomprehensiveunderstandingofthem.
Keyword:
antisenceRNAtechnique;RNAitechnique;biologicalcharacteristics;moleculemechanisms;preparation;application;future
1．概念
1．1反义RNA技术：
反义RNA（antisenceRNA）是一种与特异的mRNA互补的RNA分子，它通过配对碱基间氢键作用于对相应的RNA而形成双键复合物（即反义RNA：
mRNA二聚合体），抑制RNA的翻译过程。
而反义RNA技术是指，利用人工合成或生物体合成特定互补RNA片段或其化学修饰产物来抑制或封闭基因表达的技术。
1．2RNA干扰技术：
RNA干扰（RNAinference,RNAi）是指双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的诱导与之同源互补的mRNA降解，使相应基因的表达关闭，从而引发基因转录后水平沉默的现象。
2．机理
2．1反义RNA抑制基因表达机理
无论是真核细胞还是原核细胞，均含有反义RNA。
许多实验证明,病毒和细菌中反义RNA的调节或抑制基因活性是普遍存在的。
迄今在原核生物中发现的反义RNA共11种，其中9种作用在翻译水平，1种在转录水平，1种在复制前水平。
[1]而真核生物中也发现有自然存在的反义RNA,并有将人工构建的反义RNA注入细胞进行基因调控成功的报道。
例如,向脊椎动物细胞内输入肌动蛋白的反义RNA表达质粒,可以明显抑制肌动蛋白基因的表达,进而使细胞形态发生改变。
又如,1990年国内报道,反义C一Ha一ras寡聚核等酸可以干扰C一Ha一ras癌基因的表达,抑制P21蛋白合成等。
反义RNA被认为是一种基因表达的抑制因子。
它在复制水平、转录水平和翻译水平上都能对相关基因的表达进行调控[2]，其作用方式主要表现在以下几个方面:
2．1．1在DNA复制水平的调控
ColE1等其他有关质粒复制的前提条件是合成适当的RNA引物（RNAII）,它可以折叠形成一定的构象,与模板DNA恰当地结合。
而反义RNA（RNAI）在一些蛋白质分子作用下,与RNAII及其前体配对,不但阻止了RNAII与DNA模板间的变性,而且还抑制了RNaseH对RNAII前体的加工,因此无法产生合适的引物,使ColE1的复制受到抑制。
2．1．2在转录水平的调控
Okamoto和Freundlich认为,ticRNA结合于crpmR2NA的5′端,这种分子间形成的结构,类似于RNA聚合酶识别的转录终止信号的二级结构。
在此,反义RNA的作用方式与衰减子的作用方式相似,以反式作用对转录过程本身进行调控。
2．1．3在翻译水平上的调控
micF、sar及IS10的反义RNA可以结合于靶mRNA的SD序列及编码区,从而抑制核糖体与mRNA的结合,直接参与翻译水平的调控。
近来,Malmgren等的研究结果也显示,在质粒R1中,虽然反义RNA、CopA并不能与repAmRNA在SD序列完全配对,但二者之间同样能形成吻触复合体（kissingcomplex）,阻止核糖体在此处的结合[3]。
另一方面,Krink和Wulff（1987）通过研究oopRNA对cII基因的调控推测,反义RNA与靶RNA互补区段结合,形成RNA:
RNA双链结构,RNaseIII可以特异性地对其识别,并将二者剪切掉,这种间接调控影响了翻译的进行。
2．2RNAi的生物学特性和作用特点
2．2．1RNAi具有以下几个重要的生物学特性:
1RNAi是SiRNA介导的转录后水平的基因沉默,目前认为它对染色体DNA的复制和转录过程没有影响。
2高度特异性:
RNA只引起与dsRNA同源的mRNA降解,并不影响其他基因mRNA的表达[4]。
3高效性:
相对少量的dsRNA就能有效抑制靶基因的表达,这表明dsRNA介导的RNAi是以催化放大的方式进行的,因此dsRNA的抑制作用要比反义RNA的抑制作用高出上十倍。
4种属时效性:
RNAi效应在低等生物中可以持续存在,但在哺乳动物细胞中只能维持一段时间,一般在注入dsRNA后的2～3h作用最明显,持续2～3d。
5传播性和遗传性:
RNAi效应可以突破细胞界限,在不同细胞甚至生物体间长距离传递,并且可以传递给子代[5-7]。
2．2．2RNAi与转录后水平的基因沉默（PTGS）、共抑制（cossuppression）、基因压制（quelling）的关系。
上述几个概念之间有着密切的关系：
PTGS是指内源性基因在“异常RNA”（aberrantRNA）的诱导下发生基因沉默的调控过程。
被抑制的基因能够正常转录,但转录后的mRNA产物会被迅速的降解掉而无法积累和发挥功能,所以属于转录后水平的基因沉默机制。
共抑制是指内源性基因在转基因或病毒感染的诱导下发生的基因沉默现象,大部分是转录后水平的基因沉默,但在一些植物中转基因诱导基因功能的抑制涉及基因特异性甲基化过程,所以它也可以是转录水平的基因沉默。
基因压制是指存在于真菌中由转基因诱导的抑制转基因自身和相应内源基因表达的转录后水平基因沉默现象[5]。
经过多年的研究,目前人们普遍认为RNAi、PTGS、cossuppression、quelling都属于转录后水平的基因沉默过程,并且可能具有相同的分子机制。
2．2．3RNAi的分子机制
迄今关于RNAi的分子机制主要有两种理论。
其一是“随机降解PCR模式”,其二是“核酸内切酶的切割模式”[8]。
随机降解PCR模式是以SiRNA作为引物,让它与互补的靶mRNA相结合,在RNA依赖的RNA多聚酶（RdRp）作用下,以靶mRNA为模板合成1个cRNA与靶mRNA杂合的双链RNA,然后这个cRNA/mRNA双链RNA被Dicer酶降解,导致靶mRNA的降解,同时又可以产生新的SiRNA。
核酸内切酶的切割模式则认为长序列的dsRNA导入细胞后,被剪切成长度约21～25个核苷酸的双链小分子RNA片段（SiRNA）,SiRNA作为引导RNA（gRNA）与蛋白复合物相结合,形成一种RNA诱导的基因沉默复合体（RISC）。
在ATP的参与下,活化的RISC识别与SiRNA具有同源互补序列的靶RNA,对其进行切割,产生RNAi效应[9-10]。
2．2．4 非特异性干涉现象
科研人员在对哺乳动物RNAi的研究中发现转染的长链dsRNA超过30nt就会引起非特异性的蛋白质合成抑制和mRNA降解,而并不是人们所希望得到的特异性基因表达抑制。
这种非特异性抑制过程是宿主细胞对于应激或病毒感染的一种防御性反应,即干扰素反应。
其原因可涉及两个方面,其一是长链dsRNA激活dsRNA依赖性蛋白激酶PKR,活化的PKR可以使翻译起始因子eIF2α的小亚基磷酸化失活,从而全面阻断蛋白质的翻译过程。
其二是PKR被dsR2NA激活后,还可以使2′,5′多聚腺苷酸磷酸化,从而激活非特异性的RNasel,降解RNA[5,11]。
3．获得的制备方法以及实验方法
3．1反义RNA制备
3．1．1利用诱导剂诱导合成
既然原核真核生物中均存在反义RNA,说明生物体存在有指导反义RNA合成的基因,可通过寻找适当诱导剂使该基因开放、激活,从而获得相应的反义RNA。
3．1．2采用重组DNA技术构建反义表达载体
首先分离相应的mRNA,以mRNA为模板合成互补DNA,再以该DNA链为模板合成有意义DNA链,形成双链DNA分子,将双链DNA分子反向拼接于质粒中形成反义表达载体,转录时表达载体将合成反义RNA。
图1：
反义RNA表达载体的构建
Fig.1:
TheConstructionoftheExpressionCarrierofAntisenceRNA
3．1．3利用Qβ复制酶技术扩增
利用Qβ噬菌体的变体MDV-I（具有RNA复制酶的识别和起始序列）作为载体,用RNaseT,将其63位（G）和64位（U）之间切开,插入外源RNA片段组成重组RNA分子,若将MDV-I的CDDA与质粒PBR322组成重组体可以在体外扩增任一长度的RNA分子。
该技术可以在体外高效地拷贝RNA分子序列。
步骤为先分离mRNA以此作为Qβ复制酶的模板,由Qβ复制酶催化合成互补单链产物micRNA，在产物链合成后,模板桩和产物链都能从复制复合物中释放出来,两者又均可游离作为下一轮合成时的模板。
如此往复,RNA可呈指数相扩增。
3．1．4体外化学合成
化学合成反义RNA其优点总可以随意设计序列,但价格比较昂贵,一般只适用于合成比较小的RNA分子
3．2RNAi的实验步骤
3．2．1SiRNA的设计
首先检索感兴趣的核苷酸序列,并了解各个片段的功能。
通常在起始密码子下游50～100nt以后寻找AA（N19）TT或AA（N21）序列作为潜在的SiRNA靶位点。
G/C含量在35%～50%之间为最佳,应该避免选取高G含量或连续的G区段。
在EST文库或特定组织内的mRNA序列中,用BLAST检索所选序列的同源性,确保该SiRNA只针对靶基因。
对所选序列进行二级结构分析,去除有复杂结构的序列。
另外选取一些与序列无关的SiRNA作为对照以排除非特异性影响,通常是将选中的SiRNA序列打乱后重新排列,同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。
一般我们针对靶向基因先设计3～4对SiRNA,再筛选出最有效的SiRNA[6,12]。
3．2．2SiRNA的制备
目前主要有5种SiRNA的制备方法。
化学合成法:
直接通过化学方法,以核苷酸单体为原料合成2条互补的长21～23bp的RNA单链,然后退火形成双链SiRNA复合体。
该方法主要用于将已经找到最有效的SiR2NA进行大量合成[13-14]。
体外转录法:
设计针对靶序列的正义链和反义链,分别在其上游接上T7启动子,进行体外转录获得单链RNA,杂交后形成dsRNA,然后在体外用RNA酶消化,从而获得SiRNA。
该方法适用于SiRNA有效片段的快速筛选[15-16]。
RNaseIII家族体外消化法:
将200～1000bp的靶mRNA作为模板,用体外转录的方法制备针对此序列的长片段双链dsRNA,然后用RNaseIII（orDicer）在体外消化,得到各种不同的SiRNA混合物。
该方法的主要优点是跳过了检测和筛选有效SiRNA序列的步骤,适用于快速研究某个基因的功能[17-19]。
SiRNA表达载体法:
通过转染含有RNA聚合酶III启动子U6或H1,及其下游一小段特殊结构的质粒或病毒载体到宿主细胞内,转录出短发夹RNA（shRNA）,shRNA在胞内被Dicer酶剪成SiRNA而发挥作用。
该方法主要适用于长时间基因功能的研究[20-22]。
SiRNA表达框架法（SECs）:
利用引物延伸法进行PCR,产生包含1个RNA聚合酶III启动子U6或H1、一小段编码shRNA的DNA模板和1个RNA聚合酶III终止位点的表达框架,然后直接转染到细胞内表达shRNA而发挥作用。
该方法是筛选SiRNA最有效的工具[23-24]。
3．2．3RNAi作用的检测
RNA干扰效果的检测方法是多种多样的,如:
检测转染细胞上清液或动物血清中靶基因表达产物可以用Westernblot和ELISA方法;检测转染细胞和组织中靶基因表达水平可以用免疫组织化学方法;检测靶基因mRNA水平可以用Northernblot、斑点杂交技术及RT-PCR方法;检测靶基因DNA水平可以用Southernblot、斑点杂交技术及PCR荧光定量分析方法等等。
3．2．4应用领域
⑴相同领域：
在以下的相关领域中RNA干扰技术以及反义RNA技术都有着不同程度的应用以及巨大的发展前景。
①研究基因的基本功能：
反义RNA技术：
由于反义RNA能高度特异地与相应mRNA结合抑制特定基因的表达,因此,在不需分离鉴定基因产物的情况下,揭示该基因的功能,这远比通过突变体认识人类基因优越,因在人类有些基因的突变体往往是隐性或致死的,从而弥补了经典遗传学在研究脊推动物方面的缺陷,并能使突变机制解祈更容易。
RNA干扰技术
由于RNAi具有高度的序列专一性,可以诱导靶mRNA降解,导致转录后基因沉默,抑制特异性蛋白表达,引起细胞表型改变。
因此它被视为功能基因组学领域有力的研究工具。
目前RNAi技术已经成功的在低等生物中进行了大规模、高通量基因水平的研究。
随着人类基因组测序的完成,RNAi技术在人类基因组计划的后功能基因组研究中将发挥更重要的作用[27-28]。
②遗传疾病方面
反义RNA技术：
随着料学的发展,人们逐渐认识到越来越多的疾病与遗传有关。
遗传病在很大程度上是体内遗传物质基因发生改变,成为致病基因在体内表达而引起的。
目前一般认为对遗传病尚无真正根治办法,反义RNA技术被认为是目前最具吸引力的手段之一,人们只需分离出致病基因的转录产物mRNA,合成反义RNA,转入细胞内即可抑制致病基因的表达,从而达到治疗多拷贝基因遗传病的目的。
RNA干扰技术
RNAi通过设计序列特异性的SiRNA,封闭与某种疾病相关的基因,有可能治疗与此种已知DNA序列基因相关的疾病,特别是单基因遗传病,如多聚谷氨酰胺神经退行性病、脊髓延髓肌肉萎缩症（SBMA）等等[8，25]。
③抗癌抗肿瘤
反义RNA技术
在肿癌分子生物学的研究中发现，几乎所有人类恶性肿瘤中都发现了激活的癌基因,提示原癌基因的异常表达或其突变体的表达是致癌的关键之一。
怎样才能使癌基因失活而又不使正常的原癌基因失活呢？
采用反义RNA技术可以做到这一点。
我们可以从癌组织中分离出mRNA,从而合成相应的反义RNA,并将后者引入癌细胞阻止癌基因的表达,抑制癌蛋白的产生,从而达到控制恶性生长的目的。
前叙用C一Ha一ras寡聚核苷酸干扰C一Ha一rasmRNA的翻译就是一个成功的例子。
RNA干扰技术
肿瘤的发生是一个多因素、多步骤共同作用的结果,它的发生发展机制与原癌基因的激活、抑癌基因或凋亡相关基因的失活密切相关。
针对性的选择在癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、生长因子及关键酶,通过PTGS进行封闭结合从而达到治疗肿瘤的目的,是肿瘤基因治疗的一个重要研究方向。
RNAi技术因其具有高度特异性、高效性及低毒性等特点已经成为治疗肿瘤的新思路。
目前的研究已经包含肿瘤的发生发展、侵袭转移、信号传导、细胞周期调控、凋亡及治疗等多个方面,涉及到的肿瘤相关基因靶点包括KLF4,bcl-2,bcr-abl,Trp-53,k-ras,ErbB1,VEGF,MDR1,c-myc等等[28-30]。
④抗病毒
反义RNA技术
反义RNA针对目标基因特异性强,副作用小,很适合用于治疗目的。
尤其容易用于治疗病毒感染疾病,因病毒核苷酸的序列比较明确,易于人工合成相应的反义寡聚核苷酸抑制病毒基因在宿主细胞内的表达,起到抑制病毒繁殖的目的。
据报道,采用这一技术抑制流感病毒、疱疹、病毒、AIDS病毒的体外实验已获成功。
RNA干扰技术
病毒性疾病是一类传染性强、危害大的疾病。
由于病毒是非细胞型微生物,必须进入宿主细胞内才能复制,所以特异性抑制病毒在宿主细胞内复制是控制病毒感染和传播的关键。
目前研究的焦点主要集中在对人类有较大威胁的肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒上。
有研究表明病毒mRNA对SiRNA介导的基因沉默是高度易感的,这提示通过用SiRNA的序列特异性干扰作用来封闭病毒基因在宿主细胞内复制将成为成为治疗病毒性疾病的重要手段[27]。
⑵不同领域：
胚胎干细胞（RNAi在胚胎干细胞研究中的作用）:
因为RNAi技术能特异、高效的抑制特定基因的功能,所以它被用于研究胚胎发育、胚胎干细胞分化及制备转基因动物等多个方面。
有研究人员报道RNAi对胚胎发育、干细胞的增殖分化有着巨大的影响,这表明RNAi将成为干细胞研究领域中的重要工具[25，31]。
4．问题和展望
4．1反义RNA技术
从对反义RNA的深入研究了解到,此类分子所参与的RNA/RNA相互作用方式,赋予了反义RNA技术多方面的优越性:
2
①反义RNA所介导的基因表达阻抑效应是特异的,其调控对象是有选择性的;
②低丰度的反义RNA,同样可以产生高效的阻抑作用;
③反义RNA不能翻译产生蛋白质,因此反义RNA技术在基因工程上的应用具有很大的安全
性;
④技术操作简单易行,适用范围广泛。
但是，尽管应用前景广阔,但还有不少的具体问题有待于解决，有下：
4.1.1如何大量、便宜地制备反义RNA和提高其使用效率。
目前已有资料表明反义RNA：
mRNA二聚体在动力学上有瓦解的倾向,因此需给予比mRNA过量的反义RNA,看来采用重组DNA技术构建反义表达载体和利用Qβ复制酶技术扩增反义RNA是一个很有价值的研究方向。
另一方面注重提高反义RNA的使用效率,重点在增强其抗酶解的能力,现一般采用对反义RNA进行化学修辞的方法,也可考虑将反义RNA与roboyxyme结合,促进双链RNA分子中mRNA的水解,从而提高反义RNA的使用效率。
例如，利用反义RNA能对基因表达进行调控的特点,设计出一段与靶RNA互补的RNA片段,使其与靶RNA碱基配对,以抑制与疾病发生直接相关的基因的表达,达到治疗疾病的目的[32,33]。
反义RNA在封闭基因表达时,具有特异性强、操作简单等特点,可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病及严重感染性疾病。
不过,如何得到与靶RNA互补的反义RNA是个很关键的问题,同时也需要很高的费用。
那么怎样对反义RNA技术进行改进,使它更为便利、费用更为低廉呢?
2002年,Childs等人发明了一种新型的反义RNA技术———RNA错折叠[34]。
该技术中所使用的反义RNA比常规反义技术中所使用的RNA要短的多,只需8～12个核苷酸就能破坏一个长达400个核苷酸的RNA分子。
这对于代价昂贵的反义技术来说,不仅节省了一大笔费用,引起的副作用也比较小。
反义RNA技术成功地抑制了疱疹病毒、流感病毒、HIV、肉瘤病毒等对组织细胞地侵袭,而寡核苷酸导向的RNA错折叠技术开辟了反义RNA技术发展的新方向。
虽然RNA错折叠技术目前还不是很成熟,仍处于基础研究阶段,在不久的将来,RNA错折叠技术有望成为治疗肿瘤、病毒、细菌传染性疾病等的重要手段之一[34]。
除了医学等相关领域，反义RNA技术因为操作简单,准确高效,受到植物基因工程研究工作者的普遍关注。
在植物基因功能及植物生理代谢途径，植物基因工程，比如果实性状上的控制，植物抗病性研究，改变油料作物种子脂肪酸含量，以及植物雄性不育及其育性恢复研究中的应用等方面都取得了较大进展，同时目前正在进行的具有巨大开发前景的研究项目还有:
利用反义RNA技术改变花卉颜色,调控植物淀粉合成途径,增加植物对除草剂的抗性,转基因植物中标记基因及选择标记的封闭,改变植物中淀粉的含量等许多方面[35]
4.1.2如何使反义片段容易地、完整地进入细胞。
4.1.3如何解决好反义片段的特异性问题。
反义RNA应只与特异的mRNA结合,而不应该与其它的mRNA结合。
一般说来在一定的范围内,反义片段越长特异性越高,但过长的RNA自身局部形成双链区、影响反义RNA：
mRNA二聚体的形成。
目前已发现反义RNA不需与mRNA等长,究竟多长为适,值得研究。
综上所述,反义RNA作为一种新的生物工程技术已向人有展示了广阔的应用价值,随着科学的不断发展,反义
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