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系统生物学概论计算系统生物与医学室

系統生物學概論

期末報告

Propane-1,3-diol

第12組

934255林世昌

934289王嘉宏

938302黃嘉茂

PartI1,3-Propanediol簡介

一、前言

1，3-丙二醇（1，3－PDO）是無色透明無味液體，與水、醇、醚等互溶，難溶於苯、氯仿。

1，3－PDO與二元酸反應生成聚酯，與對苯二酸反應生成1，3－PDO對苯二酸酯（PTT）。

1，3－PDO無腐蝕性，中等毒性，由於易生物降解，對環境影響小。

表單的頂端

Name

Propane-1,3-diol

1,3-Propanediol

Trimethyleneglycol

Formula

C3H8O2

Mass

76.0942

Structure

表單的底部

表單的底部

1990年代初，由於1，3-PDO的工業用途相對較少，全球的1，3-PDO的工業產量很低，價格卻較高。

1990年代中期工業上成功地開發出以1，3-丙二醇為原料的新型聚酯材料--聚對苯二甲酸丙二醇酯，簡稱PTT。

1998年在美國PTT被評為六大石化新產品之一，世界很多跨國化學工業公司如殼牌、杜邦等也都對它產生了濃厚的興趣。

目前由於合成PTT的原料-1，3-PDO的合成方法的改進，成本大大降低，使工業生產合成纖維的前景非常看好。

1，3-PDO不僅是良好的溶劑、抗凍劑、保護劑，由於它含有雙功能基還可以參與多個化學合成反應，如二氧六環的合成，以它為單體可以生產出特殊場合使用的聚酯、聚醚、聚氨酯等縮聚物。

1990年代合成出新的聚酯材料聚對丙二甲酸丙二醇酯（PTT），研究表明PTT較聚對苯二甲酸乙二酯（PET）、聚對苯二甲酸丁二酯（PBT）具有更加獨特的性質。

PTT纖維柔軟，具有良好的彈性回復性和回彈率，伸長20%後的PTT纖維可恢復至原狀，性能明顯優於PET、PBT等纖維；在全色範圍內無需添加特殊化學品即能呈現良好的連續印染特性和良好的著色性，色度牢固，染色成本較低，環境污染少；具有良好的抗紫外、抗靜電、抗臭氧、耐污、耐磨洗性質；以PTT為原料生產的薄膜還具有良好的生物降解性。

基於PTT纖維上述的良好性質，PTT的應用開發也將進一步升溫。

PTT在地毯、織物、工程熱塑性塑料及製造薄膜方面有較好的應用。

現1，3-PDO的工業應用主要集中在聚酯纖維PTT的生產上。

二、生產方法

1.環氧乙烷法

1．1一步法0XO過程制備1，3－PDO

反應以EO為主要原料，與合成氣（一氧化碳、氫氣）反應生成1，3－PDO。

EO主要以乙烯氧化制備得。

1．2兩步法EO合成1，3－PDO

2丙烯醛法

2．1丙烯醛法的生產

　　商業生產丙烯醛法的方法為丙烯氧化法，現在所有烯醛的生產都是以含鉍、鉬等多組分復合催化劑通過丙烯與空氣氧化制備。

反應式如下：

　　　　　　CH2＝CHCH3＋O2→CH2＝CHCHO＋H2O

主要副產物為二氧化碳，其次為丙醛、丙酮、乙醛等。

2．2由丙烯醛制1，3-PDO

丙烯醛水合製3－羥基醛一般採用酸性催化劑。

諸如，離子交換樹脂、酸性分子篩或固載化的礦物酸。

3－羥基丙醛經過加氫還原為1，3－PDO。

　　　　　CH2＝CHCHO＋H2O→HOCH2CH2CHO　　　3－羥基丙醛

　　　　　HOCH2CH2CO＋H2→HOCH2CH2CH2OH　　1，3－PDO

丙烯醛水合3－HPAL的副產物為4－氧代庚二醛，一步加氫為4－氧代庚二醇，該物質水解可以生成1，3PDO。

　2HOCH2CH2CHO→OHCCH2CH2OCH2CH2CHO＋H2O　　　　　　

　　　　　　　　　　　　　　4，氧代庚二醛

OHCCH2CH2OCH2CH2CHO＋H2→HOCH2CH2CH2OCH2CH2CH2OH

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4-氧代庚二醇

HOCH2CH2CH2OCH2CH2CH2OH＋H2O→2HOCH2CH2CH2OH

三、微生物發酵

近期微生物發酵逐漸成為各國研究的熱點，並取得很大進展。

1，3-PDO可以通過發酵甘油來生產，並在多種細菌中，例如克雷伯氏菌（Klehsiella）、檸檬酸菌（Citrobacter）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、腸桿菌屬、乳桿菌屬發現了能夠生產1，3-PDO的菌株。

經研究發現，甘油是經過兩步酶促反應轉化為1，3-PDO的：

第一步，在脫水酶的催化作用下甘油轉化為3-羥基丙醛（3-HP）和水；第二步，3-HP被與NAD+相連的氧化還原酶還原為1，3-PDO。

1，3-PDO不再被進一步代謝，因而在培養基中積累。

整個反應消耗等當量的還原性輔助因子-NADH。

一般是以甘油為唯一的碳源在厭氧條件下進行，沒有其他的還原性等價物受體，產量較少。

為此，人們通過加入還原性等價物的輔助底物來提高產量，典型的底物是可發酵糖類。

在各菌株中，克雷伯氏肺炎菌（Klebsiellapneumoniae）DSM2026和丁酸梭狀芽孢桿菌（Clostridiumbutyricum）DSM5431生產1，3-PDO的收率和產率相對較高，採用批式發酵方式，l，3-PDO的質量濃度都達到了50-60g／l。

由於Clotridiumbutyrium的安全性比較好，被認為具有潛在的應用價值。

而Klehsiellapneumoniae發酵速度比Citrobacter快，1，3-PDO產率高，其對甘油的耐受性是Citrobacter的兩倍。

用KlebsiellapneumoniaeDSM2026將甘油轉化為1，3-PDO的反應式如下：

3C3H8O32CH2OHCH2CH2OH+CH3COOH+CO2+H2+H2O

由反應式可見KlebsiellaPneumoniae對甘油的理論選擇率為66.7%。

德國的Tag.C.G.採用該菌種，在PH＝7、溫度為37℃的批式發酵條件下，甘油的轉化率可接近100%，但由於甘油價格昂貴，上述生物法還不能很好地適用於工業化生產。

1、國外技術進展

1-1歐洲天然菌種發酵進展

　　德國、法國、丹麥等國針對甘油過剩的現狀紛紛開展甘油轉化1，3-PDO的研究工作，他們主要採用各種天然菌種，已取得了許多可喜的成果。

其中荷蘭學者以葡萄糖為輔助底物採用Citrobactorfreundii菌在厭氧條件下，經48h後甘油的轉化率達91%；法國研究人員採用從河床、池塘的淤泥中分離出來的Clostridiumbutyricum新菌種來發酵甘油，有報導指出德國科學家採用ClostridiumbutyricumDSM5431批式發酵培養液已成功地將中試攪拌反應釜放大到2m3，該研究還得到結論：

工業微生物反應器放大到10m3以上不會增加難度。

1-2美國DuPont公司基因工程菌的技術進展

　　美國DuPont公司和Genecor公司採用廉價的葡萄糖為底物，以基因工程菌為發酵微生物制備1，3-PDO，從1997年開始，已發表多項專利。

合作第一階段，DuPont公司採用Genecor的Design－PathTM技術開發出高級生物技術，成功地將來自三種不同微生物的DNA組合到一個菌株上，從而使生產率提高了500倍。

該法由濕磨玉米粉制得的葡萄糖利用Genencor公司開發的基因改造大腸桿菌分兩步制得PDO：

在大腸桿菌中插入取自釀酒酵母的基因，從而將葡萄糖轉化成甘油；插入取自檸檬酸桿菌和克雷伯氏菌的基因，將甘油轉化為PDO。

DuPont公司從該菌種中分離出甘油脫水酶和1，3－PDO氧化還原酶的基因，最後產物與細胞基質分離，再經蒸餾、提純得成品。

下一階段，Genecor和DuPont公司將提高其他效率，其中包括精製微生物，以提高生物催化性能。

四、研究新進展

（1）DuPont公司採用單糖（葡萄糖或果糖）或多糖（纖維素、澱粉）等碳水化合物作碳底物，在合適條件下使一種碳底物與含有編碼的一種活性甘油脫水酶、或二酶脫水酶的基因的微生物接觸轉化為1，3-丙二醇。

（2）以葡萄糖為輔助底物發酵生產1，3-丙二醇的研究，發現葡萄糖單獨作為底發酵時不產生1，3-丙二醇，以葡萄糖和甘油為混合底物時，可顯著提高菌體濃度。

但是1，3-丙二醇濃度和甘油1，3-丙二醇轉化率沒有提高，通過添加葡萄糖作為輔助底物，在提高菌體濃度的同時，可避免葡萄糖對過程的抑製作用，顯著提高最終發酵中1，3-丙二醇的濃度、甘油的1，3-丙二醇的轉化率。

（3）DuPont公司採用單糖或多糖微生物發酵制備，1，3-丙二醇的技術取得重大突破。

Shell公司由環氧乙烷羰基化、氫化制備1，3-PDO的技術亦有重大進展，其成本與DuPont公司差不多。

Degussa公司由丙烯醛水合、氫化制備1，3-丙二醇的方法、技術已基本成熟。

（4）日本化學技術DPT公司受韓國三菱公司委託，開發了1，3-PDO的生產工藝。

DPT以自己的加氫及精製技術，以現有的聚酯樹脂作原料使其轉化為1，3-PDO，現在英國DPT公司的技術中心正在進行工藝的程序開發，據悉已有數家公司引進了該技術。

（5）DuPont公司生產PTT原料來自德國緯塞林、基於石化路線生產的1，3-PDO。

新的工藝是基於澱粉（糖）發酵法生產1，3-PDO的生物發酵催化路線且已開發成功，DUPont公司與TaTe&Lyle公司（英國）Genencer國際公司（美國）合作投產了穀物而不是石油生產1，3-PDO的中型裝置。

以穀物用生物發酵法製造PTT的總費用比以石油化工廠產品製造的要便宜25%。

在新的發酵工藝中，由磨碎的潮濕穀物發酵得到的葡萄糖經2步轉化成1，3-PDO。

第1步由細菌先發酵轉化成丙二醇，第2步將丙二醇發酵轉化成1，3-PDO。

（6）戴維（Davy）工藝技術公司（DPT）和韓國三星先進技術研究院聯合生產1，3-PDO，三星的專利技術用環氧乙烷均相加氫、酯化生成羥基酯中間體，中間體再用DPT公司加氫和精製技術使之轉化為1，3-PDO。

（7）Shell公司進行了新法，1，3-PDO工藝試驗，傳統方法是通過環氧乙烷羰基化反應生成3-羥基丙醛中間體，然後加氫得到1，3-PDO。

但是由於3-羥基丙醛（HPA）會發生自縮聚反應而產生副產物，從而降低1，3-PDO的收率，後發現以甲基-3-羥基丙酸鹽進行加氫即可成1，3-PDO，且收率高。

五、結語

目前具有工業應用前景的1，3-PDO生產工藝是環氧乙烷法（EO法），丙烯醛水合加氫法（AC法），這2種方法已實現工業化，技術成熟可行；以穀物為原料的微生物發酵法（MF法），預計可在未來幾年將實現工業化並將佔有一定優勢。

具體而言：

（1）丙烯醛路線反應條件比較溫和，工藝簡單，加氫工藝成熟，催化劑體系簡單，對設備要求不高；但丙醇本身也是一種重要的有機中間體，成本高，而且屬於劇毒易爆物品，難以儲存和運輸。

但開發技術相對容易。

（2）環氧乙烷法設備投資大，技術難度高，催化劑體系複雜，工藝要求苛刻，配位物劇毒，如採用該工藝需要有比較高的綜合技術水平，但是該法原料易得、產品成本低。

（3）生物法生產1，3-丙二醇條件溫和，操作簡單，副產物少，無環境污染，隨著研究的不斷深入，以玉米類為原料生產1，3-丙二醇技術、存在著潛在的商機和應用開發前景。

PartIIModel設計

由E.coli的體內的酵素作用機制，參與1,3-PD合成的有glycolysis、glycerolipidmetabolism和pyruvatemetabolism。

見下圖：

虛線箭頭為E.coli本身沒有的酵素，需利用基因工程加到E.coli中，E.coli本身有可以產生glycerol的酵素，作為1,3-PD的反應物，但產量不高，故一般均是利用glycerol產量高的菌株來生產glycerol，如果要利用E.coli，除了加入強力的酵素提高glycerol的產量外，阻斷glycolysis的路徑，強迫glycerol的生成也是一種方式，見下圖：

由圖可知glycolysis的必須路徑glyceraldehyde-3Pglycerate-3P有兩個pathway可以選擇，正常狀況下為glyceraldehyde-3Pglycerate-1,3P2glycerate-3P，另一個pathway：

glyceraldehyde-3Pglycerolglycerate-3P可以產生glycerol，因此若阻斷正常的pathway，理論上可以得到glycerol，再利用殖入的酵素產生1,3-PD，詳細pathway見下圖：

在增加glycerol產量時，需考慮到過量的glycerol是否會抑制細菌的生長，根據研究顯示真正抑制細菌生長的不是glycerol本身，而是磷酸化的glycerol-3P，因此為了增加E.coli對glycerol的耐受性，我們認為應該阻斷glycerolglycerol-3P。

提高了glycerol的產量，該如何提高1,3-PD的產量？

考慮NADH的平衡，在無氧的環境下，細菌無法利用電子傳遞鏈消耗TCAcycle產生的NADH，因此需加快其他可消秏NADH的反應產生NAD+，以維持TCAcycle的運作：

3-Hydroxypropanal+NADHPropane-1,3-diol+NAD+

Pyruvate+NADH+H+R-Lactate+NAD+

第一式可產生1,3-PD，加快反應有助於1,3-PD產生，第二式產生副產物lactate，若讓NAD+只由第一式生成，在需求量相同的情況下，反應速率定比兩個反應同時生成NAD+時還要快，故阻斷第二式，以增加1,3-PD的產量。

除了TCAcycle需要NAD+當反應物外，還有三個反應需要NAD+：

Glycerol+NAD+D-Glyceraldehyde+NADH+H+

D-Glyceraldehyde+H2O+NAD+D-Glycerate+NADH+H+

此二個反應需NAD+，有助於增加1,3-PD的產量，且為必須的反應，另一反應：

Pyruvate+CoA+NAD+Acetyl-CoA+CO2+NADH

此反應可消耗NAD+，亦有助於增加1,3-PD的產量，但有另一反應：

Pyruvate+CoAAcetyl-CoA+Formate

此反應一樣可產生Acetyl-CoA但不消耗NAD+，不利增加1,3-PD的產量，故阻斷此反應。

E.coli會產生的副產物除了lactate和formate外，還有acetate

因為acetate產生的過程不涉及NAD+的消耗或補充，故不阻斷。

若考慮到Acetyl-CoA的消耗，因為Acetyl-CoA進入TCAcycle量的多寡影響NAD+的消耗量，故理論上如阻斷acetate的生成，可以增加Acetyl-CoA進入TCAcycle的量，進而增加NAD+的消耗量，加速1,3-PD生成，但在無氧環境下，TCAcycle應該不活躍，所以即使阻斷，對整個產生的生成影響不大，所以我們不阻斷acetate的生成。

我們的model結論為：

Glucose

Fructose-1,6-P2

Glycerone-PGlyceraldehyde-3P

GlyceronePropane-1,3-diol

Glycerol3-Hydroxypropanal

GlyceraldehydeGlycerateGlycerate-3PPyruvateAcetyl-CoA

AcetateTCAcycle

上圖藍色酵素代表需加入E.coli者，黑色酵素代表需阻斷者。

討論

1、我們的model設計阻斷glycolysis正常的pathway，理論上細菌仍可以正常生長，但實際狀況則不可知，如果此法會使細菌死亡，則可考慮不阻斷glycolysis的pathway，但如此則需考慮如何增加glycerol的生成。

2、Model建立NAD+的平衡上，但NAD+牽涉許多其他反應，因此有可能連帶影響其他反應進行，最甚者細菌無法生長。

3、無法預知菌種對於各種產物的耐受性，過量的產物可能導致細菌死亡。

4、有些中間產物牽涉到其他的反應，阻斷使中間產物消失，影響其他反應進行。

5、已有實驗證明在培養的過程程中加入某些物質，或者培養的方式改變，可以增加產量，這些結果均不能在此model中得到。

6、若真的要用E.coli，需要改變的gene有很多，事實上也有人在尋找產量高的菌種，所以真要得到高量的產物，我們覺得使用比E.coli更適合，做較少改變的菌種，可以有較高的成功率。

產率計算

根據參考資料數據，我們嘗試計算1,3-PD的產率，依據生產速率可以將整個生產過程分成二個部分：

利用可測得的反應物及產物，計算出1,3-PD的產率約為42%，但因此參考資料的菌種並不符合我們設計的model，故不能代表我們的model的產率。

參考資料

•SkralyFA,LytleBL,CameronDC.Constructionandcharacterizationofa1,3-propanedioloperon.ApplEnvironMicrobiol.1998Jan;64

（1）:

98-105.

•BieblH,MenzelK,ZengAP,DeckwerWD.Microbialproductionof1,3-propanediol.ApplMicrobiolBiotechnol.1999Sep;52（3）:

289-97.Review.

•ZengAP,BieblH.Bulkchemicalsfrombiotechnology:

thecaseof1,3-propanediolproductionandthenewtrends.AdvBiochemEngBiotechnol.2002;74:

239-59.Review.

•NakamuraCE,WhitedGM.Metabolicengineeringforthemicrobialproductionof1,3-propanediol.CurrOpinBiotechnol.2003Oct;14（5）:

454-9.Review.