实习二细胞存活曲线测试与结果分析.docx
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实习二细胞存活曲线测试与结果分析
实习二细胞存活曲线测试与结果分析
一、目的要求
实习目的是了解克隆形成法检测细胞存活曲线实验方法的原理与基本步骤，熟悉细胞存活分数与受照剂量（Gy）之间的剂量－效应关系，以及与存活曲线结果分析处理有关的软件使用，掌握细胞存活曲线的测试、绘制与结果分析的正确方法。
具体要求：
1，计算细胞接种效率PE；2，应用SPSS软件计算单击多靶模型下不同的n和k值，正确阅读运算结果；3，根据实际获得的n和k值，进一步计算出D0、Dq和D37值，以及增敏比SER；4，利用EXCEL软件计算出不同剂量照射下细胞的理论存活分数预测值，绘制存活分数预测值与照射剂量间的剂量效应曲线。
二、实验原理
放射生物学中细胞死亡是指细胞丧失完整增殖能力的一种死亡。
当细胞受到电离辐射照射后，受照细胞可呈现“间期死亡”，或曰即刻死亡，也可能呈现为“增殖性死亡”，即受照细胞形态上仍然保持完整，而且有能力制造蛋白质、合成DNA，甚至还能再经过一次或n次有丝分裂后，才突然变性死亡。
鉴于上述细胞死亡定义和照射后细胞死亡的实际情况，细胞放射生物学通常采用细胞克隆（集落）形成试验来检测照射后细胞的存活状况。
细胞克隆是在体外培养时由一独立的单个健康存活细胞直接分裂增殖而形成的细胞群体。
在计数克隆数目时，通常把含50个以上细胞的克隆计为一个细胞集落，代表一个存活细胞。
在描述细胞存活分数（SF,survivalfraction）与电离辐射吸收剂量（Dose,Gy）间的定量关系时，通常有单击单靶和单击多靶两种模型。
而哺乳类细胞受照后存活曲线多近似地符合单击多靶模型。
根据模型对原始数据进行拟合分析可以获得细胞存活曲线的数学表达式及其具有生物学意义的一些参数。
例如在单击多靶细胞克隆存活模型中，Dq值的大小反映细胞抵抗电离辐射修复亚致死损伤的能力。
因此电离辐射细胞存活实验就是要通过检测与拟合细胞存活曲线，获得诸如D0、Dq、k和n等一系列参数，从而根据这些参数对细胞的放射敏感性作出定量的评价。
三、细胞存活曲线实验的基本步骤
细胞准备与照射细胞照射前，取体外培养处于对数生长期的人宫颈癌细胞HeLa细胞，用0.125%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数细胞浓度。
设假照射对照组和0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0Gy7个照射组，每组设3个平行实验瓶。
于25cm2培养瓶中，按剂量分组每瓶分别接种细胞100、200、400、1000、2000、4000、8000、16000个细胞，于37℃，5%CO2下正常培养。
接种6－12小时后细胞已贴壁生长，将培养细胞转移至钴源室接受照射处理。
其中，假照射对照组细胞不接受照射处理。
细胞培养、克隆计数与平均存活分数（SF）的计算将接受照射后的细胞放回细胞培养箱继续培养，每三天更换新鲜培养液一次。
待培养至10－14天后弃去培养基，用0.5%结晶紫染色贴壁细胞。
计数并记录不同照射剂量下各组培养瓶中细胞存活克隆个数。
根据假照射处理组细胞克隆形成数目，计算细胞接种效率（PE）；各照射处理组细胞存活分数（SF）为各组细胞克隆形成的平均数除以相应细胞接种数与接种效率的乘积。
细胞存活分数（SF）与辐射剂量之间数学模型的建立
哺乳细胞接受不同剂量的电离辐射照射后，细胞存活的规律大多是符合单击多靶细胞存活模型，即SF＝1-[1-EXP（-k*D）**n]。
根据实验实测细胞存活数据进行该数学模型的非线性回归拟合分析，可获得单击多靶细胞存活模型的一系列有意义的参数，如k、n、D0、D37和Dq。
其中，k为细胞存活曲线的钝化常数，其值可由拟合曲线方程直接给出；n称外推数，代表理论上的靶数目，数值大小也是由拟合方程直接给出。
D0、D37和Dq是根据k、n值演算出来的，D0称为平均致死剂量，是理论上使每个细胞平均被击中一次所需要的辐射剂量，数值上D0＝1/k；Dq称为准阈剂量，表征修复亚致死损伤的能力，即克服单击多靶曲线中“肩宽”的剂量，数值上Dq＝lnnxD0；D37是细胞存活分数为37%时相应的辐射剂量，在单击多靶模型中D37＝D0+Dq。
细胞存活单击多靶模型（下图）的表达式为：
SF=1-（1-e-kD）n
SPSS软件对单击多靶模型的数学拟合，求出模型中k和n参数值大致步骤如下：
计算、整理不同辐射吸收剂量D下细胞的平均存活分数SF（校正接种效率后的平均存活分数，这是第一步），制成剂量D与存活分数SF的二维表格；启动SPSS软件,定义变量名D和SF、字段宽度以及小数点后位数，将SF显示精度定为小数点后4位数，并输入D和SF的原始数据；选择SPSS软件中非线性回归（Nonlinearregression）窗口，将SF设置为因变量（Dependent），数学公式表达模型中输入1-[1-EXP[-k*D]**n]，同时将模型参数k和n迭代的起始值分别设置为0.0001，同时将模型参数k和n数值各自限制在大于或等于0.0001以内，保存上述分析条件；迭代拟合的算法方式选择levenburg-Marquadt，为绘制存活曲线图方便，显示项中选择根据拟合方程计算出的细胞存活分数的理论预测值；执行运算并显示出SPSS特有的结果文件。
在运算结果显示文件中有不同迭代过程剩余的残差平方和、根据1-[1-EXP[-k*D]**n]拟合后的最终优选k和n参数值、以及k和n的统计学显著性检验概率等。
最终优选的k和n参数值最为重要，是我们模拟计算的目的。
此节是本次实验的重点与难点，有关详细过程可参考六、SPSS软件使用指南参考。
单击多靶模型中D0、Dq和D37值，以及增敏比SER的计算
根据最终优选的k和n参数值，我们可以进一步计算出D0，D37和Dq，其相互之间的关系式如下:
同一细胞株接受不同因素（如乏氧、增敏剂等）处理后再行照射，细胞存活曲线及其参数会发生变化，根据这些参数的变化我们还可进一步计算出增敏比（sensitivityenhanceratio，SER），SER增敏比反映细胞放射敏感性的不同及其变化。
SER一般大于或等于1，SER越大说明经该试剂处理或缺氧后对辐射表现出更加敏感。
SER=Dq（未接受化学处理或有氧情况下对照组）/Dq（接受化学处理或无氧情况下处理组）
有研究表明，实体瘤细胞因缺血缺氧而表现出肿瘤细胞的内质网应激。
Tun（衣霉素）具有抑制细胞内糖蛋白的糖基化修饰，从而导致内质网应激的发生。
本次实习是利用Tun和另一种内质网应激试剂DTT一起对肿瘤细胞株HeLa细胞进行预处理，再行电离辐射照射。
因此本次实验我们要求同学利用附后的实验结果，对内质网应激是否具有增强辐射敏感性的作用提出评价，另外如若要做出此实验结论时您还希望要做的进一步补充实验是什么，请说明为什么。
利用EXCEL软件对细胞存活曲线的绘制最终优选的k和n参数值后除了可以进一步计算单击多靶模型中D0、Dq和D37值以及增敏比SER外，我们还要求同学利用k和n参数值回代到该模拟公式中，对不同辐射剂量D下的存活分数进行理论预测，然后利用理论预测的存活分数SF值与实际给予的辐射剂量D之间绘制一条平滑的存活曲线。
绘制过程大致步骤如下：
启动EXCEL软件；输入不同剂量值D；fx栏输入=1-POWER[（1-EXP（-k*D）,n]公式，其中k和n值换成来自SPSS模拟方程的计算结果，运算各剂量组细胞存活分数预测值；根据各组剂量值D与细胞存活分数SF预测值建立数据二维表；启动绘图XY散点标准模式，输入标题、纵横轴名称【如HeLa细胞伽玛照射后存活曲线单击多靶模型图、SF、Dose（Gy）】，去掉网格线、图背景阴影、图例和线框；点击Y轴坐标轴，选刻度项，修改最小刻度0.01，最大刻度10，主要刻度10，次要刻度10，数轴交叉于0.001，选对数刻度；点击各组各点，选数据系列格式，线型选自定义，线形平滑；图幅大小设置5X20。
获得曲线图之后，我们也可以在不同预测曲线上添加出实测存活分数值，同学们由此可观察到理论预测值与实际值之间的真实差异，这种差异也可以反映在运算结果显示文件中显著性检验分析上。
四、实习作业
演算练习，根据以下Tun和DTT组数据计算各自D37增敏比（SER）并作图。
Dose
cellseedingnumber
CTRsurvivalcellnumber
CTRmeancellnumber
Tunsurvivalcellnumber
Tun
mean
cell
number
DTT
survivalcellnumber
DTT
survivalcellmean
0
600
411
390
300
0
600
427
427
365
0
600
442
427
442
420
432
366
0.5
600
283
362
293
0.5
600
324
349
316
0.5
600
217
275
280
330
290
300
1
1000
322
344
353
1
1000
202
380
301
1
1000
288
271
327
350
324
326
2
4000
344
492
511
2
4000
357
408
458
2
4000
342
348
601
500
546
505
6
8000
260
305
300
6
8000
233
324
298
6
8000
203
232
281
303
363
320
8
10000
88
122
169
8
10000
112
85
100
8
10000
94
98
154
120
172
147
五、SPSS软件使用指南参考：
下面以原始数据进行1-[1-EXP[-k*D]**n]非线性回归方程拟合为例详细讲解SPSS软件的使用。
照射剂量与平均细胞存活分数原始数据整理如下：
组别
Dose（Gy）
平均（SF）
0
0.00
计算PE用
1
0.00
1.00
2
2.00
0.70
3
4.00
0.30
4
6.00
0.10
5
8.00
0.02
第一步:
启动SPSS,定义变量名,并把SF显示为精度4位数,便于和拟合数据比较!
!
其中定义变量名非常关键
第二步:
激活Analysis菜单选Regression中Nonlinear...项，弹出NonlinearRegression对话框,依次进行如下图中操作,其中ModelExpression的选项非常关键,本例为1-（1-EXP（-k*D））**N
第三步:
点击上图中Parameters,出现下面的对话框,进行如下图的设置:
第四步:
打开限定条件对话框后,依次进行如下图的设置,至于为什么要进行这种限定,以及这样限定的合理性,简单解释:
k肯定大于0,N也肯定大于0,所以就设置他们都大于一个很小的数字吧,这样设置的巧妙性在于避免SPSS拟合过程中出现诸如（-3）^2.5这样的死步骤。
给好限定条件后,会跳出一个框子提醒你什么什么什么,不管他,继续望下走
显示项中选择根据拟合方程计算出的细胞克隆理论存活分数预测值；迭代拟合的算法方式选择levenburg-Marquadt，保存各种所选条件等
第五步:
回到拟合界面对话框后,依次进行下图操作,目的是根据拟合方程显示理论预测值,其中拟合算法很关键,请一定要按照图中所示进行,最后点击OK。
一切结果就显示出来啦!
!
ConstrainedNonlinearRegression
Allthederivativeswillbecalculatednumerically.
Thefollowingnewvariablesarebeingcreated:
NameLabel
PRED_PredictedValues
IterationResidualSSkN
0.1.5885643726.000100000.000100000
1.1.4326928450.000100000.010267659
2.1.2644240765.000100000.032263147
3.2.2460533309.000100000.040666221
4.1.2353237999.000550799.058576000
5.1.2343114615.000749210.065273484
6.1.2310963020.001052919.068291791
7.1.2267676825.001668720.074229208
8.1.2253204323.001932692.071071008
9.1.2252782354.010525019.155223311
10.1.2114927788.007972194.123511525
11.1.2072941880.007258942.105891983
12.1.2037004224.008892185.114062200
13.1.1849657836.020745415.163259238
14.1.1678978737.036031833.217246455
15.1.1359764487.073514715.341227935
16.1.0696285850.177899360.683299005
17.1.0193661970.3970542741.40880796
18.1.0192417786.3931284801.39728887
19.1.0187180868.3790873691.36145913
20.1.0180956915.3717613231.35257103
21.1.0160190997.3640753701.38506874
22.1.0126064378.3751342921.51881114
23.1.0059547114.4289360571.90344372
24.1.0019056787.5007576152.39973577
25.1.0011632693.5290739082.63477892
26.1.0006871616.5469015662.82717444
27.1.0003546795.5574224162.99265985
28.1.0002842715.5604100253.06737893
29.1.0002815003.5614781273.08761846
30.1.0002814377.5618414173.09187019
31.1.0002814332.5619615613.09297517
32.1.0002814332.5619699613.09301099
Runstoppedafter32majoriterations.
Optimalsolutionfound.
NonlinearRegressionSummaryStatisticsDependentVariableSF
SourceDFSumofSquaresMeanSquare
Regression21.59012.79506
Residual32.814332E-049.381106E-05
UncorrectedTotal51.59040
（CorrectedTotal）4.69152
Rsquared=1-ResidualSS/CorrectedSS=.99959
Asymptotic95%
AsymptoticConfidenceInterval
ParameterEstimateStd.ErrorLowerUpper
k.561969961.019670604.499369321.624570602
N3.093010989.2050164822.4405570433.745464936
AsymptoticCorrelationMatrixoftheParameterEstimates
kN
k1.0000.9452
N.94521.0000
第六步:
阅读结果文件。
结果文件详细显示了叠代步骤和最终优选的参数值，以及残差平方和等等,本例结果如下:
结果分析如下：
SF=1-（1-EXP（-0.562*D））**3.093
根据上式k=0.562和N=3.093可以演算出以下参数：
D0=1/k=1/0.562=1.779
Dq=lnn*D0=ln3.093*1.779=2.009
D37=D0+Dq=1.779+2.009=3.788
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