教学目的使学生了解原核生物和真核生物的RNA聚合酶.docx
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教学目的使学生了解原核生物和真核生物的RNA聚合酶
课次：
10
教学目的：
使学生了解原核生物和真核生物的RNA聚合酶、启动子和终止子,掌握原核生物和真核生物的RNA聚合酶、启动子的结构特点及原核生物终止子。
重点：
原核和真核生物RNA聚合酶的组成和转录特点，启动子的结构特点及原核生物终止子。
难点：
复习旧课：
提问3人，了解教学效果。
导入新课：
第五章转录
基因表达时以DNA的一条链为模板合成RNA，这一过程就是转录（transcription）。
所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolynerase,DDRP）。
转录产生初级转录物为RNA前体（RNAprecursor），它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。
细胞中的RNA分成三种：
mRNA（信使RNA），tRNA（转运RNA）和rRNA（核糖体RNA）。
在DNA的两条多苷酸链中只有其中一条链作为模板，这条链叫做模板链（templatestrand），又叫做无意义链。
DNA双链中另一条不做为模板的链叫做编码链，又叫做有意义链，编码链的序列与转录的RNA序列相同。
第一节转录酶和转录因子
RNA合成的基本特征：
5’→3’方向；
底物三磷酸核苷酸（NTP）
不对称转录，以单链DNA为模板。
不需要引物，合成是连续的。
一原核生物的RNA聚合酶
大肠杆菌RNA聚合酶（RNApolynerase）
需要DNA模板，Mg离子，和4种3-磷酸核苷（ATP，UTP，CTP和GTP）。
RNApol和DNApol也有2点不同：
（1）RNApol没有任何校对功能；
（2）能起始新的RNA链。
细菌RNApol由5种多肽亚基组成为α2β'βσω；分子量达50多万，可以合成3类不同的RNA（tRNA，mRNA和rRNA）。
其大小和功能如表所示：
表E.coliRNAPol的结构和功能
亚基
基因
分子量（KDa）
数目
组分
可能的功能
α
rpoA
40
2
核心酶
酶的连接，装配，决定哪些基因被转录
β
rpoB
155
1
核心酶
与转录全过程有关,和底物（核苷酸）结合
β’
rpoC
160
1
核心酶
结合DNA模板
ω
10
1
核心酶
σ
rpoD
70
1
σ因子
辨认起始点,
二真核生物的RNA聚合酶
真核生物RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和线粒体RNA聚合酶，分子量大致都在500KD左右，它们专一性地转录不同的基因，因此由它们催化的转录产物也各不相同。
表2真核生物的RNA聚合酶
种类
分布
合成的RNA类型
Ⅰ
核仁
28s,18s,5.8srRNAs
Ⅱ
核质
hnRNA，SnRNA
Ⅲ
核质
tRNA，5sRNA，SnRNA
Mt
线粒体
线粒体RNAs
不同的真核聚合酶对各种抑制剂的敏感性也不同（表）
某些常用的转录抑制剂
抑制剂
靶酶
抑制作用
利福霉素
细菌的全酶
与β亚基结合，阻止起始
链霉溶菌素
细菌的核心酶
与β亚基结合，阻止延长
放线菌素D
真核RNA聚合酶Ⅰ
与DNA结合，并阻止延长
α-鹅膏蕈碱
真核RNA聚合酶Ⅱ、III
与RNA聚合酶Ⅱ结合
2.1真核RNA聚合酶的结构特点：
所有真核RNA聚合酶都是大分子蛋白质，分子量可达500KDa或更多。
它们典型的有8-14个亚基。
RNApolⅡ的大亚基有一个羧基末端功能区（carboxy-terminaldomainCTD），它含有一个多次重复的一致序列Tyr-Ser-Pro-Ser-Pro-Ser，这个序列是RNApol独有的。
此CTD在Ser丝氨酸或Thr苏氨酸残基上可高度磷酸化，这个酶带有非磷酸化亚基叫做RNApolⅡa，而带磷酸化亚基叫做RNApolⅡo，CTD参与转录的起始。
2.2线粒体和叶绿体的RNApol
线粒体和叶绿体转录的RNApol较小，更类似于细菌的RNApol。
第二节启动子
一原核生物的启动子
启动子（promoter）是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
1启动子（promoter）的结构
不同启动子对RNA聚合酶的亲和力各不同，根据其合成蛋白质的多少区别为强弱启动子。
1.1转录起始点：
多为嘌呤，CAT，A为起始点
1.2-10区
又称为Pribnow盒（原核生物）。
其保守序列为TATAAT（T80A95T45A60A50T96），其中3′端的“T”十分保守。
A.T较丰富，易于解链。
和转录起始位点I一般相距5-bp。
只有少数几个核苷酸的差别。
其功能是:
（1）RNApol紧密结合部位;
（2）形成开放启动复合体；（3）使RNApol定向转录。
1.3-35序列又称为Sextama盒（Sextamabox），其保守序列为TTGACA（T82T84G78A65C54A45），与-10序列，相隔16-19bp。
其功能是:
为RNApol的识别位点。
σ亚基才能识别并结合-35序列，为转录选择模板链。
1.4-10和-35之间距离：
1）-35和-10序列相距约16-19bp，其距离稳定，过大或过小都会降低转录活性。
2）该距离大致是双螺旋绕两圈的长度。
这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，此酶是结合在双螺旋的一面。
3）原核生物亦有少数启动子缺乏这两个序列之一。
RNA聚合酶往往不能单独识别这种启动子，而需要有辅助蛋白质的帮助。
1.5启动子附近其他DNA序列：
⏹起始位点上游50到150bp之间的序列是启动子的完全活性所必需的。
⏹上游序列可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。
⏹远离部位序列富有AT，能增进转录起始的频率。
2原核生物不同基因的启动子的共同特点：
（1）结构典型，都含有识别（R），结合（B）和起始（I）三个位点；
（2）序列保守，如-35序列、-10序列结构都十分保守；
（3）位置和距离都比较恒定；
（4）对RNA聚合酶的亲和力高低影响转录频率和效率；
（5）常和操纵子相邻；
（6）都在其控制基因的5’端；
（7）决定转录的启动和方向。
二．真核生物的启动子
与原核的启动子的区别：
（1）多种元件：
TATA框，GC框，CATT框，OCT等；
（2）不同元件的组合情况：
位置、序列、距离和方向都不完全相同；
（3）需转录因子参与转录的全过程。
转录因子先和启动子结合，再与RNA聚合酶形成转录起始复合物，开始转录的过程。
2.1RNApolⅡ的启动子
通用型启动子（无组织特异性）、结构最复杂、位于转录起始点的上游、有多个短序列元件组成
（1）帽子位点（capsite）：
转录起始位点
（2）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框）
结构特点：
Ø位于－30处
Ø一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）
功能：
Ø定位转录起始点（类似原核的Pribnow框）
ØTATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的
Ø故也称为选择子（selector）
3）CAAT框（CAATbox）
结构特点：
位于－75bp处，一致序列为GGC/TCAATCT
功能：
前两个G的作用十分重要（转录效率），增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性
☻以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在
（4）GC框（GCbox）
位于－90附近，较常见的成分，核心序列为GGGCGG，可有多个拷贝，也可以正反两方向排列
（5）其他元件，
八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件）：
一致序列为ATTTGCAT
KB元件：
一致序列为GGGACTTTCC
ATF元件：
一致序列为GTGACGT
还有一些位于起始点下游的相关元件
（6）起始子（initiator，Inr）：
位于起始点-3～+5Py2CAPy5构成，可能提供RNApolⅡ识别。
当有的基因缺少TATA框时，可能由Inr来替代它的作用，
无论TATA是否存在，Inr对于启动子的强度和起始位点的选择都是十分重要的。
2RNApolⅠ启动子
RNApolⅠ的启动子由两部分序列构成：
核心启动子（corepromoter）或核心元件（coreelement），位于起始位点的前后，从-45到+20，负责转录的起始。
上游控制元件（upstreamcontrolelement，UCE），从-180延伸到-107，此区可增加核心元件的转录起始的效率。
这两个区域都有一个特殊的成份，就是G.C丰富区（G.C含量达85%）。
3PolⅢ启动子的结构及起始
RNApolⅢ启动子负责tRNA,5SrRNA，某些SnRNAs的转录，这三类基因的启动子结构不同。
基因内启动子：
如5SRNA和tRNA，位于起始位点的下游的转录区内，因此也称为下游启动子（downwtreampromoter）或基因内启动子（intragenenicpromoter）或称为内部控制区（internalcontronregin,ICR）。
又分为两类：
Ⅰ型内部启动子含有两个分开的boxA和boxC序列。
而Ⅱ型内部启动子含有两个分开的boxA和boxB。
RNApolⅢ的三种类型启动子的结构如图5-2所示。
167页
基因外启动子：
如snRNA基因的启动子，包含有3个上游元件，为TATA框、次近端序列元件（proximalsequenceelement,PSE）和八聚体OCT元件。
第三节终止子
一原核生物的终止子（terminator）
终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。
两种不同的终止子：
1强终止子/内部终止子/不依赖ρ因子的结构特征：
（1）具有一个反向重复序列，由它转录出mRNA可形成茎环结构，可阻止RNApol的前进；
（2）茎的区域富内含G-C，使茎环不易解开；
（3）强终止子3′端上有6个U，由于它和模板形成的连续U-A配对较易打开，从而便于释放出RNA。
2依赖ρ因子的终止序列中，也没有固定的特征，不都能形成稳定的发夹；在茎中的G、C含量少，茎环易打开。
在其3′端也没有寡聚U。
ρ因子46Kda的蛋白，6聚体（275KDa）存在。
ρ因子具有依赖RNA的ATPase活性和解旋酶活性。
其功能是作为RNApol的一种辅助因子，当其浓度为RNApol浓度的10%时在体外可发挥最高的活性。
ρ因子作用机制的可能性：
[1]ρ因子与新生RNA链结合，延着RNA移动，并可能用ATP放出的能量将RNA链从酶和模板中释出。
比RNApol沿DNA移动要快。
[2]ρ因子可能与RNA聚合酶结合，接触RNA-DNA杂合链、并导致其解链，而将聚合酶和RNA解离下来。
二真核生物的终止子
真核生物由于RNA转录后很快就进行了加工，因此很难确定原初转录物的3’末端。
爪蟾5sRNA的3’末端有4个U，它们前后的序列为富含G·C的序列，这是所有真核生物RNA聚合酶Ⅲ转录的终止信号。
这种序列特征高度保守，从酵母到人都很相似。
RNA聚合酶I的转录终止信号是18bp,RNA聚合酶II还不清楚是否有明确的终止元件。
归纳小结：
原核和真核生物RNA聚合酶，启动子、终止子。
布置作业：
问答题
1.σ亚基的主要作用是什么？
2.真核生物RNA聚合酶有何功能特点？
3.概括典型原核生物启动子的结构和功能。
教学后记：
课次：
11
教学目的：
使学生了解原核生物和真核生物的转录机制、原核生物转录产物的加工，掌握真核生物RNA聚合酶II的转录因子的作用特点。
重点：
真核生物RNA聚合酶II的转录因子的作用特点。
难点：
转录起始的过程
复习旧课：
提问3人，了解教学效果。
导入新课：
第四节转录的机制
⏹转录可分为三个阶段：
起始，延伸和终止。
一转录的起始
1原核生物转录的起始
1当RNA聚合酶的σ亚基发现其识别位点时，全酶就与启动子的-35区序列结合形成一个封闭的启动子复合物。
2由于全酶分子较大，其另一端可在到-10区的序列，在某种作用下，整个酶分子向-10序列转移并与之牢固结合，在此处发生局部DNA12-17bp的解链，形成全酶和启动子的开放性复合物。
3酶移动到转录起始点，在开放性启动子复合物中转录起始位点和延长位点被相应的rNTP核苷酸前体充满，在RNA聚合酶β亚基催化下形成RNA的第一个磷酸二酸键，表示了RNA转录开始。
4在第一个核苷酸形成时σ因子从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的σ因子与另一个核心酶结合成全酶反复利用。
2真核生物转录的起始
2.1RNApolⅡ的转录起始
转录因子与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。
普遍转录因子，或者是基本因子TFⅡX，存在于所有启动子起始的RNA合成过程中。
它们与RNA聚合酶共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置上开始。
表人类Ⅱ型基因的转录因子
因子
分子量
功能
RNAPolⅡ
≥10K
依赖模板合成RNA
TFⅡA
12,19,35K
稳定TFⅡD和DNA的结合，激活TBP亚基
TFⅡB
33K
结合模板链（-10～+10），起始PolⅡ结合，和TFⅡE/F相互作用
TFⅡD
TBP,30K
TAFs
TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别特殊启动子
TFⅡE
34K（β）,57K（α）
结合在PolⅡ的前部，使复合体的保护区延伸到下游
TFⅡF
38,74K
大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基（rap38）和PolⅡ结合，介导其加入复合体
TFⅡH
具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸
TFⅡI
120K
识别Inr，起始TFⅡF/D结合
TFⅡJ
在TFⅡF后加入复合体，不改变DNA的结合方式
TFⅡS
RNA合成延伸
（1）第一步是原称为TFⅡD的转录启动因子和TATA框结合形成复物体，为RNApolⅡ指明结合位置。
（2）TFⅡA的参与使TFⅡD和TATA框结合得更稳定。
（3）TFⅡB在起始点邻近区域，从-10到+10可以部分地保护模板链，还可以使TFⅡE/ⅡF相互作用。
（4）TFⅡF的大亚基RAP74，具有ATP-依赖性DNA解旋酶活性，和起始时DNA链的熔解有关。
小亚基是RAP38，和细菌的σ因子有部分同源，紧密地和RNApolⅡ结合。
RNAPolⅡ结合位点在模板链上达到下游+15，在非模板链上达到+20，其长度贯穿了整个复合体，上游也被其保护了。
（5）TRⅡE结合在pol的前部，使复合体的保护区延伸到下游双链的+30处。
（6）TRⅡH和TRⅡJ在TRⅡF之后也加入复合体中，但并不改变DNA的结合方式。
TFⅡH具有激酶活性，可以磷酸化RNApolⅡ尾巴上的CTD，CTD的磷酸化使polⅡ从转录因子中释放出来，这样就能离开启动子开始延伸。
这一起始过程和细菌RNApol催化的反应是相似的。
在没有TATA框的启动子上起始何发生呢？
这种起始同样需要一些基本的转录因子，其中也包括TFⅡD。
TFⅡD可能带有一个或多个TAFs来直接识别Inr，并与之结合。
2.2RNA聚合酶I转录起始
●核心启动子（corepromoter），负责转录的起始。
●上游控制元件（upstream,controlelementUCE），可增加核心元件的转录起始的效率。
●这两个区域都有G.C丰富区（G.C含量达85%）。
RNApolⅠ需要2种辅助因子：
UBF1（上游结合因子1）和SL1因子。
UBF1是一个单链多肽，它可以特异的和核心启动子和上游控制元件UCE的G.C丰富区结合。
UBF1和RNApol可在异源模板上发挥功能。
SL1含有4个蛋白，其中之一称TBP，TATA框结合蛋白，也是polⅡ和polⅢ起始时所需的一种蛋白质因子。
SL1在起始转录时具有种的特异性。
SL1的行为与细菌的σ因子相似，其初步功能可能是保证RNA聚合酶能位于起始位点的合适位置上。
2.3RNA聚合酶III的转录起始
表RNApolⅢ启动子的转录因子的结构和功能
因子
结构
功能
TFⅢA
38Kda,有9个锌指
结合于1型内部启动子（5sRNA基因）的C框，使ⅢC结合在C框下游，辅助ⅢB定位结合
TFⅢB
含TBP和另外二种蛋白
定位因子，使Pol结合在起始位点上
TFⅢC
含τA和τB，有5个亚基
τA结合A框，起启动子的作用；τB结合Ⅱ型内部启动子（tRNA基因）的B框，起增强子的作用。
辅助ⅢB定位结合
TⅡD
含TBP亚基
结合TATA框，确定选择PolⅢ
PBP
次近端结合蛋白
可能和ⅡD一道辅助ⅢB定位结合的另一途径
只有TFⅢB才是polⅢ所必需的起始因子。
TFⅢB的功能是作为一个“定位因子”（positioningfactor），负责RNApol结合正确位置上。
TFⅢA和TFⅢC仅是一种装配因子（assemblyfactor），它们的作用是辅助TFⅢB结合到正确的位置上。
TFⅢB在启动子上结合在pol的前方，本身并不能和DNA结合。
需要依靠ⅢA、ⅢC协助，形成一种前起始复合体结合在特异位点上，然后再直接和pol结合。
总之，无论哪一种启动子，TBP都是起始复合物的组成部分，与RNApol的相互作用中发挥共同的作用。
通过不同机制是聚合酶结合在各种类型的启动子上。
二转录的延伸
第一个碱基加上后延伸开始，聚合酶不断前移，起始因子脱离聚合酶，而一些延伸因子与聚合酶复合物结合。
整个转录过程中产生的RNA分子与DNA模板形成大约12bp长的RNA-DNA杂交区。
在RNA链离开模板时，此杂交区即复原，同时两条DNA链即又重复螺旋化。
转录速度大约是每秒钟30-50个核苷酸。
三转录的终止（Termination）
原核生物的终止子
强终止子，也称为内部终止子。
弱终止子，又称为ρ依赖性终止子。
◆抗终止作用：
ρ因子的作用被抵消，使得RNA聚合酶通过终止子继续转录后面的基因。
抗终止作用不是更替启动子，而是转录的继续延伸。
λ噬菌体基因表达存在抗终止作用。
真核生物的RNA大部分都要经过加工，包括剪切和加上poly（A），因此对于其终止的情况了解很少，只有少数的例子搞得比较清楚。
第五节转录产物的后加工
一原核生物转录产物的后加工
转录后的加工（posttranscriptionalmodification）是指将各种前体RNA分子加工成成熟的各种RNA。
顺反子：
与多肽链相对应的DNA片段连同启动部位和终止部位。
一次转录下来的mRNA可以含有一个顺反子或是有多个顺反子。
原核生物mRNA的寿命比tRNA、rRNA的短，象细菌的mRNA半衰期只有几分钟。
mRNA很容易从5’-P降解，有些生物的mRNA5’-P端被修饰，保护，而不易降解。
tRNA和rRNA都不是最初的转录产物，这是由于：
（1）它们的5′端都是单磷酸，而原始的转录产物5′应是三磷酸；
（2）分子比初始转录物小；
（3）tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。
1rRNA的加工
大肠杆菌的rRNA有三种：
16S，23S和5S。
原核生物rRNA转录后加工，包括：
①rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ，RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子；②rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰；③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基。
2tRNA的加工
1）剪切、修剪和剪接：
剪切：
E.coli中的RNA酶P，是一种tRNA内切核酸酶，负责切割所有tRNA分子的5'端。
RNA酶P由蛋白质和RNA二者组成，分子中RNA有375个碱基长（约130KD）；而蛋白质组分要小得多，大约只有20KD。
RNA和蛋白质这两个组分对RNA酶P的催化活性似乎都是必须的。
RNA酶D，为外切酶，能从RNA的3'端一个一个地切去碱基，以产生tRNA的真正的3'端。
RNA酶Ⅱ，外切核酸酶，它能够将tRNA完全分解完。
RNA酶F是内切酶，作用在3‘端，
作用于rRNA的RNA酶III和RNA酶E对tRNA的加工也有一定的作用，但不是必须的。
拼接：
经过剪切后的tRNA分子还要在拼接酶作用下，将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。
2）核苷修饰
tRNA甲基转移酶是一种修饰酶，催化嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA，使得tRNA分子中出现稀有碱基。
3）3’末端加上CCA：
在核苷酸转移酶作用下，3’--末端除去个别碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OH末端。
在细菌中有两种tRNA前体：
Ⅰ型分子有CCA三联体在其3‘端，作3′修复的信号和最后的界线。
Ⅱ型分子没有CCA序列如某些噬菌体编码的，需要后加上CCA。
3原核前体mRNA的加工
原核生物的mRNA很少经过加工，由于转录和翻译偶联，一般情况下一边转录一边就进行翻译，中间没有可加工的间歇时间。
但在少数情况下多顺反子mRNA先被内切酶切成较小的单位再作为翻译的模板。
归纳小结：
原核和真核生物RNA转录起始、延伸和终止，原核生物转录产物tRNA和rRNA的加工。
布置作业：
问答题：
1.阐述原核生物的转录终止。
2.真核生物RNA聚合酶II的转录起始过程如何？
3.列举原核生物和真核生物转录的差异。
4.哪些转录因子含有TBP？
为什么它们被称为定位因子？
教学后记：
课次：
12
教学目的：
使学生了解真核生物转录后加工、掌握真核生物mRNA加工和内含子的剪接。
重点：
真核生物mRNA加工和内含子的剪接。
难点：
内含子的剪接机制
复习旧课：
提问3人，了解教学效果。
导入新课：
二真核生物的转录后加工
1rRNA转录后加工
真核生物的18S，5.8S和28SrRNA基因是串联在一起形成一个转录本，初始转录本为45S前体，5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录。
从中间产物的大小来看rRNA前体的加工可能有多种途径。
Hela（人类）细胞和L（鼠）细胞中rRNA的加工途径：
2tRNA转录后的加工修饰
真核tRNA的基因和原核不同：
（1）真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区;
（2）真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多;；
（3）5′端全有单磷酸核苷酸，表明已被加工过；
（4）tRNA的前体分子中含有内含子。
真核tRNA的加工和原核相似，刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性，需要进行①剪切和拼接；②甲基修饰；③3’-OH连接-ACC结构。
但也有区别：
增加了剪接内含子的过程；都要加CCA。
3真核mRNA的加工和成熟
1）．在5’端加帽
5’端都有一个m7G-PPNmN结构，该结构被称为甲基鸟苷的帽子。
O型为m7GpppN；
I型为m7-GpppN1mp，即转录出的mRNA的第一位碱基也被甲基化（C2甲基化）；
II型为m7GpppN1mpN2mp，即mRNA的第一个碱
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