华东理工大学生物催化工程考试资料.docx
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华东理工大学生物催化工程考试资料
非水相
典型的生物催化反应系统：
系统构成三要素：
反应物、催化剂和反应介质
酶可以在含有各种有机溶剂和微量水分的非水介质系统中发挥催化作用，并且所表现出的催化性能（如活力、选择性、稳定性）与在常规水溶液介质中的性能截然不同，从而极大地扩展了生物催化剂的应用范围。
当酶的催化性能不理想时,如何改造？
构象工程
酶在溶液中的空间构象是柔性可变的：
环境、结构、功能！
通过改变反应环境（溶液性质）即有可能调节酶的空间构象,优化强化酶的催化性能。
非水相生物催化的优点
（1）能提高非极性（水难溶）底物的溶解度；
（2）使热力学平衡向有利于合成的方向偏移；
（3）改变酶对底物的专一性,包括位置和立体专一性；
（4）能抑制依赖于水的某些不利反应（如酸酐和卤化物的水解，酚/醌的聚合等）；
（5）由于酶不溶于有机溶剂而无须固定化，或简单吸附于无孔表面（如玻璃珠）即可；
（6）可通过过滤或离心等简单方法回收酶，反复利用；
（7）从低沸点溶剂中可以较容易地分离产物；
（8）酶的稳定性提高；
（9）消除了微生物的污染；
（10）酶可能被直接应用于化工过程。
典型的非水相生物催化介质系统
除纯水之外的各种反应介质及无溶剂系统
Non-aqueousmedia100%有机溶剂
1..水或缓冲溶液系统；2.水-有机溶剂单相系统3.水-有机溶剂两相系统;
4.乳状液或微乳液系统5.微水有机溶剂单相系统;6.超临界流体系统7.离子液体介质系统
8.双水相系统;9.浊点系统;10.无溶剂反应系统
1.单一的水或缓冲溶液系统
由于酶的构象与其离子化状态密切相关，因此酶的体外实验研究通常在一定浓度的缓冲溶液体系中进行，这样可保证酶在最佳pH附近发挥最大的活力。
缓冲溶液的种类很多，在酶催化中使用最多的可能是磷酸盐和Tris-HCl，因为大多数酶的最佳pH在中性范围内（pH5~9），但也有例外的情况。
例如，我们发现假丝酵母脂肪酶在催化酮基布洛芬氯乙酯水解时，最大活力在pH4.0附近。
更为有趣的是，酶的对映选择率（E值）在pH4.0以下迅速升高，在pH2.2时为13.6，比pH7.0时（E=1.2）提高了一个数量级。
如果酶的最适pH在中性范围，且反应过程中不涉及pH的变化，那么也可以不用缓冲溶液，直接在水中进行酶催化。
例如，Furstoss等首次报道了在普通水中用环氧水解酶成功地制备了（S）-2-吡啶环氧乙烷。
2.水-有机溶剂单相系统
●增加亲脂性底物溶解度的一个最简单办法是向反应混合物中加入与水互溶的有机溶剂，通常被称为有机助溶剂或共溶剂（Organiccosolvent）。
●常用的助溶剂有二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、二噁烷（dioxane）、丙酮和低碳醇（如t-BuOH）等。
●由于形成的是均相系统，因此通常不会发生传质阻碍。
一般来讲，该系统中与水互溶有机溶剂的量可达总体积的10%~20%（体积分数），在一些特殊的情况下，甚至可高达90%以上。
有些酶（如酯酶和蛋白酶）在水-有机溶剂均相系统中的反应选择性会增加。
●如果该系统中有机溶剂的比例高过某一阈值，将夺去酶分子表面的结构水，使酶失活，也有少数稳定性很高的酶，如南极假丝酵母脂肪酶（CALB），只要在水互溶有机溶剂中有极少量的水，就能保持它们的催化活性。
●此外，当酶催化反应在0℃以下进行时，与水互溶的有机溶剂还能降低反应系统的冰点温度，这是低温酶学研究的内容之一。
3.水-有机溶剂两相系统
•水-有机溶剂两相系统是指由水相和非极性有机溶剂相（烃、醚、酯等）组成的非均相反应系统;两相的体积比可以在很宽的范围内变动。
•底物和产物则主要溶于有机相中;酶溶解于水相中，这样可使酶与有机溶剂在空间上相分离，以保证酶处在有利的水环境中，而不直接与有机溶剂相接触。
•在两相系统中，分配系数（热力学参数）和质量传递系数（动力学参数）决定了酶反应的拟一级速率常数kcat（=Vmax/KM）。
因此整个反应的速率主要由这两个因素（溶解度、搅拌速度等）所决定，而与酶的催化能力关系不大。
•值得注意的是增加搅拌可以增加质量传递以提高酶催化反应的速度，但不正确的搅拌会产生机械和化学张力而导致酶的失活。
•通过选择适当的有机溶剂以及适度的水相调节（如pH、盐浓度等）可以控制反应物在两相中的分配。
•如果在均相系统中存在严重的底物或产物抑制，那么使用两相系统可望在很大程度上缓解这一问题。
4.乳状液与微乳液系统
⏹在一些疏水性底物的生物转化反应中，还经常使用表面活性剂稳定的乳状液系统。
⏹例如，在脂肪酶催化拆分酮基布洛芬酯的水解反应中，发现添加适量的非离子表面活性剂Tween-80，不但有助于难溶底物酯的分散，使酶反应的速度提高了13倍，而且酶反应的对映选择性也大幅度提高，最多可提高两个数量级。
⏹类似地，在环氧水解酶催化的反应中，也发现添加乳化剂Tween-80要比添加助溶剂DMSO效果要好，不仅改善了酶的活性和选择性，而且提高了酶的稳定性。
逆胶束系统（ReverseMicelles）
Ø逆胶束系统是含有表面活性剂与少量水的有机溶剂系统。
表面活性剂分子由疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含水有机溶剂中，它们的疏水性基团与有机溶剂接触，而亲水性头部形成极性内核，从而组成许多个逆胶束，水分子聚集在逆胶束内核中形成“微水池”，里面容纳了酶分子，这样酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。
Ø逆胶束系统作为反应介质具有以下优点：
①组成的灵活性；②热力学稳定性和光学透明性；③逆胶束有非常高的比界面积；④逆胶束的相特性随温度而变化。
5.微水有机溶剂单相系统
•均相的有机溶剂体系是指用与水不互溶的有机溶剂取代所有的溶剂水（＞98%），形成固相酶分散在有机溶剂中的非均相反应体系。
•处于这种体系中的酶，其表面必须有残余的结构水，才能保证其催化活性。
一般有机溶剂中含有小于2%的微量水。
•常用的与水不互溶的有机溶剂有烃类、醚、芳香族化合物、卤代烃等，它们的疏水指数（logP）较大。
•固相酶在有机溶剂中具有催化活性是酶的一项重要特性，在过去二十多年的研究中，已证明这种体系是可行、可靠和多用途的。
微水有机溶剂单相系统
•固相酶在结构上仍是柔性的，酶分子内部的柔性足以保证酶和底物结合时酶能产生微小的构象变化，形成酶和底物结合的中间复合体。
•酶分子的比表面积约为（1～3）×106m2·kg－1，与活性炭相当；酶分子体积的1/3～2/3是空的，充满了溶剂；因此足够的搅拌将保证底物能与酶表面或内部的活性中心结合，并起催化反应。
•对许多酶的应用而言，显著减少反应混合物的含水量是有利的。
由于酶在低含水系统中通常不溶，故得到的是非均相反应混合物。
酶既可以以游离酶粉（无论纯度如何）的形式直接使用，也可先固定在固相载体上再使用。
•但两者都必须使酶处于对催化最适合的离子化状态，因此必须在将酶制备成粉末或固定化颗粒之前将溶液的pH调节到最佳值。
•一般而言，酶在微水有机溶剂体系中稳定性较好，但催化活力要比水相中低得多，部分原因是因为酶在有机相不溶，许多酶分子聚结成团，影响了颗粒内部酶分子的催化效率。
因此，如何保持固态酶粉在有机相中的高度分散状态，成为激活有机相酶活力的一项重要课题。
6.超临界流体
◆除了亲脂性有机溶剂外，超临界流体（supercriticalfluids），如二氧化碳、氟里昂（CF3H），烷烃类（甲烷、乙烯、丙烷）或无机化合物（SF6，N2O）等，都可以作为酶催化亲脂性底物的溶剂，酶在这些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样稳定。
◆超临界流体对多数酶都能适用，酶催化的酯化、转酯、醇解、水解、羟化和脱氢等反应都可在此体系中进行，但研究得最多的是水解酶的催化反应。
这种溶剂体系最大的优点是无毒、低粘度、产物易于分离。
◆超临界流体的粘度介于气体与液体之间，其扩散性比一般溶剂高1~2个数量级。
超临界气体在临界点附近的温度或压力有一点微小的变化都会导致底物和产物溶解度的极大变化，因而很容易调控超临界流体中酶催化反应的特性，如反应速率和选择性。
◆该体系的缺点是需要有能耐受几十个兆帕的高压容器，并且减压时易于使酶失活。
此外，有些超临界流体如二氧化碳可能会与酶分子表面的活泼基团发生反应而引起酶活性的丧失。
7.离子液体（IonicLiquids）
Ø在最近的10年中，离子液体（IonicLiquids,ILs）作为一种新型的反应介质，被用于各种类型的反应，并常常产生显著的效果，从而引起人们的广泛注意。
Ø离子液体实质上是一些凝固点较低的盐，例如1-烷基-3-甲基咪唑与PF6或BF4形成的盐。
离子液体作为一类极性溶剂，能溶解许多有机化合物。
Ø与普通有机溶剂最大的区别在于：
①离子液体不会挥发（没有蒸气压），对环境比较友好，用于工业生产也相对比较安全；②它们与许多有机溶剂互不相溶，可以形成有机溶剂-离子液体两相系统或者有机溶剂-水-离子液体三相系统，从而为溶剂工程在生物催化反应中的应用提供了新的可能。
Ø一般而言，离子液体通常有三种方式被应用于生物催化过程：
①作为单一的溶剂；②作为共溶剂添加于水相系统中；③与水形成两相系统。
8.浊点系统（cloud-pointsystem）
当一种非离子表面活性剂的水相胶束溶液温度达到其浊点（cloudpoint）以上，或者在存在某些添加剂的情况下，会导致相分离，形成一个表面活性剂稀少相（水包油乳液）和一个表面活性剂富集相（油包水乳液），后者又称凝聚相，其中包含许多大的水泡，可容纳细胞或溶解的酶分子。
这样的系统被称为浊点系统（cloud-pointsystem），它曾被用于分离技术中，即所谓浊点萃取（Cloud-pointExtraction）。
9.无溶剂或少溶剂反应系统
◆在许多情况下，反应系统的最佳选择可能是根本不用溶剂（即solvent-freesystem），或者只用很少量的溶剂（littlesolventsystem）。
◆在至少有一种反应物为液体的情况下，反应物之间的质量传递可以通过流体相进行。
◆在无溶剂系统中适当提高反应的温度，可以促进反应物分子的扩散和混合，从而提高酶反应的速度。
当反应物均为固体颗粒时，也不一定非要用溶剂使其溶解不可。
◆
反应完全可以在含酶的液相中进行，尽管该液相有可能完全隐藏在反应物固体颗粒之间的缝隙中而看不见。
为了形成这一隐形液相，一般只需加入很少量（例如反应物重量的10%）的某种“溶剂”，而最好的溶剂可能就是水，因为水通常会使酶产生最高的催化活力
有机溶剂的选择原则—logP规则
溶剂的疏水性越强，其夺取酶分子必需水的能力越弱。
logP是衡量物质疏水性强弱的一个特征参数,
P=C正辛醇/C水
关于热力学水活度
水活度（wateractivity）是指在特定的温度和压力条件下，
反应体系中水的摩尔分数χw与水活度系数γw的乘积:
αw=γw·χw
水活度系数γw是溶剂疏水性的函数，溶剂疏水性越大，γw越大。
对给定的αw来说，疏水性溶剂所需的水量比亲水性溶剂的少。
αw是一个强度性质的物理量。
为了理解水活度的概念,可将αw比喻为温度，而将水含量比喻为热焓，两个反应体系可以有相同的温度,或αw，但两者的热焓或含水量可以不同。
在平衡状态时，反应体系中各组分（酶、溶剂、底物和产物等）的αw是相同的。
pH记忆现象
•在水溶液中：
pH决定酶的离子化状态，从而影响酶的构象，而酶的构象又关系到酶的活性和选择性；
•在有机溶剂中酶不能电离，因此必须进行预处理：
将酶先溶解在少量最适pH值的缓冲溶液中，然后沉淀或冻干。
这样可以保持酶的最佳电离状态，被称为“pH记忆”。
•从最适pH值水溶液中沉淀的酶在有机溶剂介质中也表现出较高的酶活性，有时可提高一个数量级。
酶在有机溶剂中的活力为何不如水相中高？
1.扩散与可获得性因素
Ø酶溶于水而不溶于几乎所有的有机溶剂，当酶粉加到水中便形成溶液，而在有机溶剂中则通常形成悬浊液。
单凭直觉判断，以下推论似乎是合理的：
酶在非水溶剂中的活力可能会因酶颗粒对底物的扩散限制而降低。
这一现象在非均相催化（包括固定化酶催化）中普遍存在，并导致酶的催化能力不能充分发挥，实验观测到的即催化活力的下降。
Ø即使扩散限制根本不存在，也不难想象在冻干的酶粉或交联的晶体酶颗粒内部，一些酶的活性中心可能在空间上会被相邻的酶分子所屏蔽住，使得底物不能接近，造成那些被屏蔽的酶分子不能发挥催化作用，使测得的催化活力下降。
2.结构的变化
Ø造成酶在无水溶剂中活力下降的另一个可能原因是酶的构象发生了变化。
在水－有机溶剂混合体系中的蛋白质变性是众所皆知的现象，因而预期在纯的有机溶剂中蛋白变性将变得更加严重似乎也有道理。
Ø已经证实将冷冻干燥的枯草杆菌蛋白酶置于不同的无水溶剂（如：
辛烷、乙腈、二氧六环）中，对其二级结构并无显著的影响，这主要反映在－螺旋的含量上。
Ø但是，在酶的冻干过程中，却导致了枯草杆菌蛋白酶和许多其它酶的显著变性。
换言之，不是与有机溶剂的接触，而是先前的脱水过程，改变了酶的结构，从而降低了催化的活力。
使用冷冻保护剂可以防止（至少可以减少）这一有害的影响。
3.底物去溶剂化和过渡态稳定化
Ø酶与底物分子之间的结合能是酶催化的主要驱动力。
底物为了与酶结合，在其从反应介质向酶活性中心转移的过程中必须首先进行去溶剂化（desolvation）。
这一去溶剂化过程在能量上越是有利，则导致催化发生的净结合能就会变得越大。
Ø运用热力学方法，对枯草杆菌蛋白酶交联晶体在有机溶剂中催化N-Ac-L-Phe-OEt转化时的去溶剂化能进行了计算，结果表明，与水相比较，仅底物在无水乙腈中的去溶剂化能减少一项，就可使酶的kcat/Km下降100倍以上。
Ø影响酶反应活化能的另一项重要因素是酶-底物过渡态的能量。
对枯草杆菌蛋白酶和许多其它水解酶来说，其过渡态具有高度的极性，有点像一个带电荷的四面体。
由于水对高度极性的酶-底物过渡态中间体的稳定化作用要好于极性较低的有机溶剂，因此，酶在有机溶剂中的催化活力应当比水相低。
4.构象可塑性
Ø蛋白质与水的相互作用（水合作用），对很多生物学功能尤其是酶的活性，起着十分关键的作用。
水作为一种润滑剂或者增塑剂，使酶得以展现其最佳催化所需的构象灵活性。
Ø而有机溶剂一般不具备这样的能力，因为他们不能象水一样与酶发生多重氢键缔合，使得酶分子内部的氢键加强；加之有机溶剂的介电常数比水低，导致酶分子内部的离子作用增强。
两方面共同作用的结果，使得酶在有机溶剂中的结构刚性显著增加。
Ø因此，即使在其他条件完全相同的条件下，酶在有机溶剂中由于灵活性变差而造成活性比水中低。
枯草杆菌蛋白酶交联晶体在无水乙腈中单单由于构象的柔性下降，就造成了酶的活力比水相中下降了几乎2个数量级。
5.pH状况
Ø酶在水溶液中的活力显著依赖于pH，并有一个最佳值。
而在有机溶剂中由于离子基团无法电离，使得pH失去其真正的意义。
Ø可以通过其它方式来控制酶的离子基团的质子化状态。
发现酶在有机溶剂中具有“pH记忆”能力，也就是说酶的催化行为与其最后一次（比如冷冻干燥前）所处的水溶液的pH有关。
Ø因此，为使酶在有机溶剂中的催化性能达到最优，必须将酶冻干之前的水溶液的pH调到最佳值。
当然，也可使用“有机相缓冲液”（有机相可溶的羧酸及其相关盐的混合物）来调节酶在有机溶剂中的pH状态。
如何提高有机相酶的催化活力？
原因
述评
对策
扩散限制
不如多数人认为的那样严重
剧烈搅拌酶悬液；使用较细的酶颗粒。
活性中心堵塞
致使酶的活力下降数倍
如果可能的话，使用酶的晶体而不是无定型颗粒。
构象发生变化
发生于冻干或其它的脱水过程中，与有机溶剂接触时一般不会发生。
用交联晶体酶可以避免。
使用冷冻保护剂；或制备可溶于有机溶剂的酶-表面活性剂复合物；或者使用酶的交联晶体。
不利的底物
去溶剂化能
对于疏水性底物或者天然的底物情况比较严重；可使酶的活力下降100倍以上。
选择溶剂，造成不利的溶剂-底物相互作用
过渡态
去稳定化
当过渡态至少部分暴露于溶剂时，可能比较显著
选择溶剂，使得过渡态与溶剂的相互作用比较有利。
构象的灵活性降低
在无水的亲水性溶剂中情况比较严重，可使酶的活力至少下降100倍。
优化水的活度；在溶剂中添加水；使用疏水的溶剂；使用拟水溶剂，添加变性助溶剂等。
酶的pH处于次优状态
可使酶的催化活力降低100倍以上。
从pH最优的水溶液中脱水制备酶制剂；使用有机缓冲液。
酶在有机溶剂中的不同使用方式
（a）水与水溶性溶剂的均相混合物
（b）水-有机溶剂两相系统
（c）悬浮于溶剂中的酶粉
（d）悬浮于溶剂中的载体固定化酶
（e）酶增溶于由水、有机溶剂和表面活性剂组成的微乳状液
（f）可溶于有机溶剂的共价修饰酶
酶和细胞的固定化
传统的生物催化剂固定化方法
A载体结合法（a）共价结合法（b）离子结合法（c）物理吸附法（d）生化特异结合法
B.自身交联法（Cross-linking）
C.高分子包埋法（a）格子型（b）微胶囊
D.复合法例如:
吸附+交联,吸附+包埋,包埋+交联
酶为啥要固定化?
便于操作、易于分离、反复利用
固定化酶的优点
v便于分离：
固定化酶易与反应液分离，产物溶液中没有酶的残留，简化了产品提纯工艺
v重复利用：
固定化酶可较长时间地反复、分批操作或装柱连续反应，有利于工艺的连续化、自动化和管道化
v稳定性高：
固定化酶的稳定性一般会有较大提高
固定化细胞的优缺点
v优点：
▪无需酶的分离和纯化
▪胞内辅酶可以再生
▪适用于多酶系统以及复杂反应系统
▪可以连续化操作
v缺点：
▪传质限制明显
固定化生物催化剂的特征参数
（1）—酶
v生化性质
分子量、辅基、表面功能团、纯度（杂质的影响）
v动力学参数
比活力、pH曲线、温度曲线、Km,KI抵抗pH、温度、有机溶剂、去污剂等的稳定性
固定化生物催化剂的特征参数
（2）—载体
化学特性：
化学骨架与组成，功能团，膨胀行为，孔径大小、有效容积、比表面积、化学稳定性…
机械特性：
平均粒径，耐压性能，流动阻力（固定床），沉降速率（流化床），耐磨性（搅拌釜）
固定化生物催化剂的特征参数（3）
v固定化方法----结合蛋白量、酶活得率、本征动力学参数（无传质效应时测得）；
v传质效应----分配效应和内外扩散效应
▪效率因子（）—表观速率/本征速率
v稳定性
▪保存稳定性（Preservationstability）
▪操作稳定性（Operationstability）
v综合性能（一般计算至酶的半衰期为止）
▪产率（kg产品/U）或酶的单耗（units/kg产品）
固定化生物催化剂的性能评价指标
v固定化生物催化剂的活力
▪间歇测定
▪连续测定
v固定化效率（活力回收率）
▪固定化生物催化剂与被固定化等量游离生物催化剂总活力的比值
v固定化生物催化剂的稳定性
▪按短时间操作推算，实际长期操作
▪稳定化倍数：
固定化酶半衰期/游离酶半衰期
v机械强度
固定化生物催化剂的稳定化因素
v酶与载体或其他蛋白的多点结合增强了酶的刚性，避免温度及pH变化对酶的失活作用
v载体亲水性基团的存在，为酶提供了良好的亲水性环境，避免了有机溶剂对酶的失活
v固定化后，生物催化剂位于制剂的内部环境中，避免了剪切力等失活因素的影响
影响固定化催化剂性质的因素
v质量传递效应
▪降低载体颗粒的大小
▪降低酶的负载量
▪使酶优先结合在载体材料表面
v载体电荷效应/分配效应
▪对于底物介导的扩散限制，分别或同时减少酶浓度或颗粒大小
▪使用足够容量（I>0.05mol/L）的缓冲液
▪采用比该酶最适pH高的外部pH进行操作
生物催化剂的基因数据挖掘
为什么要做酶的基因克隆？
•酶在工业应用上的局限：
量少：
许多酶在野生状态下表达量较低；
娇嫩：
酶容易失活
底物的溶解性和耐受性：
天然的酶并非为工业生产而生！
整细胞实际上是多酶体系
如何升级改进？
•有了基因，可以？
从基因本质上改善酶的性质
大量重组表达
还可以研究：
结构与功能的关系、进化……
什么是生物信息学？
生物信息学利用应用数学、信息学、统计学和计算机科学的方法研究生物学的问题。
目前的生物信息学基本上只是分子生物学与信息技术（尤其是因特网技术）的结合体。
生物信息学的研究材料和结果就是各种各样的生物学数据，其研究工具是计算机，研究方法包括对生物学数据的搜索（收集和筛选）、处理（编辑、整理、管理和显示）及利用（计算、模拟）。
目前主要的研究方向有：
序列比对，基因识别，基因重组，蛋白质结构预测，基因表达，蛋白质反应的预测，以及建立进化论的模型。
基因数据库资源
•NCBI（TheNationalCenterforBiotechnologyInformation;
–http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/
•EBI（TheEuropeanBioinformaticsInstitute）
–http:
//www.ebi.ac.uk/
•DDBJ（DNADataBankofJapan）
–http:
//www.ddbj.nig.ac.jp
•SwissProt/ExPASy（SwissBioinformaticsResource）
–http:
//expasy.cbr.nrc.ca/sprot/
•PDB（TheProteinDatabank）
–http:
//www.rcsb.org/PDB/
基因组数据挖掘方法
序列比对分析（BLAST）
通过序列比对工具BLAST学习，了解蛋白编码基因的功能注释原理
介绍多序列联配工具ClustalX
序列比对的进化基础
•序列比对的目的：
–从核酸以及氨基酸的层次去分析序列的相同点和不同点，以推测他们的结构、功能以及进化上的联系
–通过判断两个序列之间的相似性来判定两者是否具有同源性
•相似性：
直接的数量关系，如：
序列之间相似部分的百分比
•同源性：
质的判断，两个基因在进化上是否曾有共同祖先的推断
酶基因数据挖掘的策略
•某一物种基因组数据库的挖掘
•综合数聚库的挖掘
•基于特定功能的基因数据挖掘
•基于特定酶特定结构域的基因数据挖掘
•关键在于什么？
宏基因组（metagenome）的概念
•基因组：
某个生物（纯培养）的全部遗传物质。
•宏基因组（元基因组，环境基因组）：
来源于环境样本的全部DNA。
–非培养微生物
–环境样本：
海水、油藏、土壤……
–1克土壤样本中可能含有上万种微生物，因此宏基因组中的单一DNA序列量很大（大于人基因组）
宏基因组技术的优势
•土壤微生物资源丰富，据估计1g土壤大约有4000-7000种近1O亿的细菌，生物量可达300~3000kg/ha。
•原因：
任何培养基和培养技术都不能完全再现土壤微生物的自然生存环境（化学和生态环境）；
•宏基因组
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