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PCR技术及应用

编号：

08级2008034118号

玉溪师范学院

期末论文

题目PCR技术及应用

学院资源环境学院

专业生物科学

指导教师申太波

学生姓名郎启国

学生学号2008034118

2010年12月18日

目　　录

摘要3

关键词3

1PCR技术基本原理及发展3

1.1PCR技术3

1.2PCR技术基本原理3

1.3PCR技术的发展4

1.3.1PCR的实现4

1.3.2PCR的改进与完善4

2PCR反应特点5

2.1特异性强 5

2.2灵敏度高 5

2.3简便、快速5

2.4对标本的纯度要求低5

3PCR扩增产物分析5

3.1凝胶电泳分析5

3.2酶切分析6

3.3分子杂交6

3.4Southern印迹杂交6

3.5斑点杂交6

3.6核酸序列分析6

4PCR技术中存在的问题6

4.1假阴性，不出现扩增条带6

4.1.1模板问题6

4.1.2酶失活7

4.1.3引物影响7

4.1.4Mg2+浓度大小7

4.2假阳性7

4.2.1靶序列或扩增产物的交叉污染7

4.2.2空气中的小片段核酸污染8

4.3出现非特异性扩增带8

4.4出现片状拖带或涂抹带8

5PCR技术对临床医学的意义8

6PCR技术在临床上的实际应用9

6.1早期诊断9

6.2药物疗效观察9

6.3病情判断和预后评价9

6.4加快疾病的诊断9

6.5疾病的发病监控10

6.6遗传疾病的诊断10

6.7母婴传播的监控10

参考文献10

PCR技术及应用

郎启国

（玉溪师范学院资源环境学院云南玉溪653100）

摘要：

PCR技术--聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是体外核酸扩增技术，它具有特异性强，灵敏度高，简便、快速，对标本的纯度要求低等特点 。

 PCR技术对于促进临床医学的发展有不可代替的意义，在临床上常运用 PCR技术进行疾病的诊断与预测等。

关键词:

PCR技术；基本原理；特点；应用

1PCR技术基本原理及发展

1.1PCR技术

PCR技术--聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

1.2PCR技术基本原理　

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

第一，模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；第二，模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；第三，引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2--4分钟，2--3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

1.3PCR技术的发展

核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：

“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

1.3.1PCR的实现

1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。

其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件--摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

1.3.2PCR的改进与完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：

第一，Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。

第二，引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。

此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。

这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。

但每循环一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（thermusaquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶。

此酶具有以下特点：

第一，耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。

第二，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。

第三，大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度（2.0Kb）。

由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。

为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶（TaqDNAPolymerase）。

此酶的发现使PCR广泛的被应用。

2PCR反应特点

2.1特异性强 

PCR反应的特异性决定因素为:

第一，引物与模板DNA特异正确的结合；　　　第二，碱基配对原则；第三，TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；第四，靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。

引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。

聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。

再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

2.2灵敏度高 

PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（ug=10-6g）水平。

能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

2.3简便、快速 

PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。

扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

2.4对标本的纯度要求低 

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

3PCR扩增产物分析

PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。

PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

3.1凝胶电泳分析

PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。

PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小，这是起码条件。

琼脂糖凝胶电泳：

通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：

6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

3.2酶切分析

根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

3.3分子杂交

分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。

3.4Southern印迹杂交

此法在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。

此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。

3.5斑点杂交

斑点杂交将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

3.6核酸序列分析

核酸序列分析是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

4PCR技术中存在的问题  

PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

4.1假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有：

第一，模板核酸的制备；第二，引物的质量与特异性；第三，酶的质量及活性；第四，PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

4.1.1模板问题

模板中含有杂蛋白质、Taq酶抑制剂，模板中蛋白质可能没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，同时在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

或者模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

4.1.2酶失活

如果需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

4.1.3引物影响

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

第一，选定一个好的引物合成单位；第二，引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；第三，引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；第四，引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

4.1.4Mg2+浓度大小

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

4.2假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　引物设计不合适，选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

4.2.1靶序列或扩增产物的交叉污染

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

第一，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；第二，除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用；第三，必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

4.2.2空气中的小片段核酸污染

空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

4.3出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

第一，必要时重新设计引物；第二，减低酶量或调换另一来源的酶；第三，降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；第四，适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

4.4出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：

第一，减少酶量，或调换另一来源的酶；第二，减少dNTP的浓度；第三，适当降低Mg2+浓度；第四，增加模板量，减少循环次数。

5PCR技术对临床医学的意义

PCR技术有操作方便、好学易懂、检测精确、出结果快而可靠等优势；尤其适合临床应用和推广。

病原体基因扩增常用于检测及鉴定微生物，评价治疗反应和检测耐药性突变等。

对感染性疾病的评价PCR已证明在许多情况下较传统方法更为优越，尤其是在鉴定不易培养，生长缓慢或不能培养的病原体时候，PCR可以快速提供诊断结果，并能同时分析多种样品；同时PCR不受药物治疗的干扰，可在治疗开始后确定感染原，为用药提供可靠的参考。

PCR几乎可以用任何组织或体液，包括新鲜与存档的手术标本来诊断疾病。

DNA是相对稳定的分子，可从木乃伊或冷冻的组织中获取标本。

指数扩增使得PCR具有极高的灵敏性，而独特的引物使用使其具有高度的特异性，且引物的使用保障了PCR技术不象其他传统的检测方法为提高特异性而牺牲灵敏性。

6PCR技术在临床上的实际应用

目前PCR应用于临床主要集中在从病原体和患者基因组中扩增与检测具有诊断参考价值的DNA片段。

6.1早期诊断

免疫学主要是抗原抗体反应，应用于临床通常是在体内产生抗体以后，而许多病原体的抗体产生存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断；但PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”。

以HCV为例，免疫学检测的“窗口期”平均长达70天，而荧光PCR可将“窗口期”缩短59天，显然有利于疾病的早期诊断。

对于乙肝、丙肝和艾滋病患者，目前临床上最常用的检测手段就是血清免疫学检测，也就是检测患者对病毒侵染机体产生的免疫反应，因此血清学检测指标可间接反映病毒的感染情况；而DAN/RNA则直接反映病毒本身在机体内的存在情况。

随着检测水平的不断提高，人们越来越意识到两者既相关又不尽相一致，临床上需要将两者结合起来对患者进行诊断、治疗和预后等判断。

6.2药物疗效观察

对病原体的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时地提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接的依据，以供治疗方案参考；同时药物治疗中可能引起的基因变异等情况更依赖核酸检测提供的直接证据。

6.3病情判断和预后评价

评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。

因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。

6.4加快疾病的诊断

许多病原体到目前为止仍旧依靠传统的细菌培养作为诊断手段，操作繁琐费时。

以结核杆菌为例，传统培养法需要1--2个月，而荧光PCR可将检测时间缩短至半天，能更及时地为临床提供诊断依据。

6.5疾病的发病监控

许多病原体尤其是病毒病原体可以在感染人体后整合入细胞基因组内而成为整合型，而一旦机体的免疫力下降等又重新进入活动期并引致发病，临床上希望通过检测病原体基因的数量变化并结合临床表现找出其活动以及是否引起发病的规律。

荧光定量PCR可以为此提供直接证据。

6.6遗传疾病的诊断

荧光PCR可以实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。

对产前诊断具有其它方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。

七6.7母婴传播的监控

PCR技术可对病原体的母婴传播途径进行有效的监控，为病原体的母婴传播阻断提供参考。

参考文献

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[4]方红辉,唐曙明,杨自华.2种荧光定量PCR试剂盒检测HBV载量的结果分析[J].实用预防医学,2009,（03）

[5]刘金华,贺丹,史艳宇,张宇,王丽.应用实时荧光PCR技术检测构巢曲霉的初步研究[J].中国生物工程杂志,2008,（10）

[6]韩剑锋,宁宜宝,宋立,杨承槐.实时荧光PCR技术快速鉴别检测H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的研究[J].生物工程学报,2007,（05）

[7]严延生,于恩庶.我国应用PCR技术于恙虫病研究的现状[J].中国人兽共患病杂志,1997,（02）

PCRtechnologyandapplication

LangQiguo

（ResourcesandEnvironmentCollegeofYuxiNormalUniversity,Yunnan,Yuxi653100）

Abstract:

PCRtechnology-PolymeraseChainReaction（PCR）Polymerasehypothesesareas,nucleicacidamplificationtechnologyisinvitro,ithasstrong,highsensitivityandspecificity,convenientandfastonthespecimenpurityrequiredlowcharacteristic.PCRtechnologytopromotethedevelopmentofclinicalmedicinehasirreplaceablesignificance,clinicallyusedPCRtechnologyfordiseasediagnosisandforecasting.

Keywords:

PCRtechnologyBasicprinciplecharacteristicsapplication