荧光量子点及其在生物中的应用.docx

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荧光量子点及其在生物中的应用

荧光量子点及其在生物检测中的应用

邹函君1曹渊*徐彦芹1甘霖2

（1重庆大学化学化工学院2重庆市肿瘤医院重庆400030）

摘要：

量子点（QDs）是一种零维的半导体纳米晶体，与传统的有机染料相比，具有独特的光学特征。

由于它们的激发光谱宽、发射光谱窄，精确可调的发射波长，量子产率高，荧光稳定性好等特点。

量子点作为新一代的生物荧光探针，已被广泛应用于生物检测。

本文介绍了QDs的基本概念和性质，探讨了QDs的制备方法及表面修饰，对其毒性也作了简要分析。

提供了QDs在荧光免疫分析、生物芯片、生物传感器及体内成像等方面的应用实例。

不管量子点技术发展的相对成功，QDs在生物分析领域仍有更广泛的潜在的应用前景。

关键字：

QDs、荧光探针、生物检测

FluorescentQuantumDotsandtheirApplicationinBiologicalDetection

ZouHanjun1,CaoYuan*1,XuYanqin1,GanLu2

（1InstituteofChemistryandChemicalEngineering,ChongqingUniversity;

2Chongqingcancerhospital,Chongqing400030）

AbstractQuantumdots（QDs）arezero-dimensionsemiconductornanocrystals.Comparedtotraditionalorganicdyes,QDsarecapableofuniqueopticalproperties.Withthisgreatdevelopment,QDsasanewgenerationoffluorescentprobehavebeenwidelyusedinbiologicaldetectionduetotheirbroadexcitationandnarrowemissionspectra,accuratesize-tunableemissionwavelength,highquantumyieldandgoodphotostability.ThisreviewbeginswithaintroductiononthebasicconceptandpropertiesofQDs,discussesthepreparationofmethodandsurfacemodificationofQDsandprovideSabriefanalysisoftheirtoxicity.TheprogressofferedbyQDsisevidencedbyexamplesonQDs-basedfluorescenceimmunoassay,biochips,biosensorsandanimalimaginginvivo.DespiteofrelativesuccessondevelopingQDstechnology,QDsstillholdalargerscalethesignificantpotentialbioanalyticalapplications.

KeywordsQDs，Fluorescentprobe，Biologicaldetection

前言

量子点（QDs）作为纳米材料中的一种典型结构，由于其独特的理化性质，受到了物理、化学、光、电、磁、生物等领域的研究者们越来越多的关注。

量子点，又可称为纳米晶，是一种由II－VI族或III－V族元素组成的纳米颗粒，其粒径一般介于1～10nm之间[1]。

又由于量子点的电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。

因此称为半导体荧光量子点，通常简称量子点。

与传统的有机染料相比，半导体荧光量子点最显著的光学特征如下：

（1）激发光谱宽、发射光谱窄而对称以及摩尔吸收系数大[2,3]，故能实现多组分检测和单波长激发的要求；

（2）精确可调的发射波长，能激发出不同颜色的光以实现同时标记和多种检测的分析[4]；（3）抗漂白能力强，不像有机染料易发生荧光猝灭，从而有利于生物过程中的长时间跟踪标记[5]；（4）荧光的寿命长，能降低背景干扰以提高检验的灵敏度[6]等。

由于这些独特的光学性质，QDs已被应用于生物识别及检测中。

本文主要探讨了Ⅱ-Ⅵ族组成的量子点在生物检测中的主要应用并对其前景作了展望，以利于量子点在生物检测领域的进一步开发和应用。

1量子点的制备及表面修饰

1.1量子点的制备

目前，Ⅱ-Ⅵ族（CdTe、ZnSe、CdS等）或Ⅲ-Ⅴ族（InAs，InP等）的量子点的制备和研究已经受到了广泛的关注。

人们已经在各种各样的体系中制备出了QDs，例如LB薄膜、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、沸石类、有机体、生物分子和导电聚合物，其制备方法主要分为有机相合成法和水相合成法。

近年来，许多课题组在有机相中合成了一系列的量子点，Stucynski[7]以二甲基镉（Cd（CH3）2）为镉源，硬脂酸（SA）、十二烷酸（LA）为溶剂，氧化三正辛基膦（TOPO）、三正辛基膦（TOP）、己基膦酸（HPA）、十四碳烯膦酸（TDPA）等为配体经过多次实验优化了反应条件，合成了CdSe,、CdS、CdTe等量子点。

然而，由于Cd（CH3）2这类有机试剂具有毒性，因此传统的有机合成法对生物体和环境有害。

其后，Peng[8]报道了以CdO代替Cd（CH3）2为前驱体，在高温下疏水体系中制备的量子点稳定性较强，分散性好而且有较高的荧光强度，还容易进行表面改性。

但是所制备的量子点的水溶性很差，从而阻碍了其在生物分析中的应用。

因此，必须解决QDs水溶性的问题，最常用的方法是进行表面配体交换。

然而，由于配体交换过程中粒子的团聚和生长，产生的QDs的稳定性不理想，荧光产率低[9]。

因此直接在水相中合成的量子点，比通过有机相合成中配体交换的QDs，在生物应用中更加可行和方便。

Aldana[10],Weng[11]在100℃以下在水溶液中合成了一系列的量子点。

相比有机合成法，水相中合成的量子点操作相对简单、毒性较小、成本较低、易溶于水。

然而，其荧光产率相对较低、稳定性不好、在空气中易被氧化。

最近，Singh[12]在水溶性合成了粒度分布窄（3±0.5nm）的CdSQDs，具有稳定性好、荧光强度高、结晶度低的特点。

1.2量子点的生物功能化

由于单独的量子点存在晶格缺陷，荧光量子产率很低。

在量子点的表面覆盖一种晶体结构相似、带隙更大的半导体材料即形成核壳结构的量子点，如：

CdSe/CdS[13]、CdS/SiO2[14]、CdSe/ZnS[15]、CdS/ZnO[16]。

它们一般是由内核（如CdS、CdSe）和惰性外壳（如ZnS或SiO2）以及包被有特定的不同活性分子的覆盖层组成，以防止内核被氧化同时减少其毒性。

能在一定程度上提高QDs的荧光产率和稳定性，可大大提高检测的灵敏度，使其更适于生物应用。

因此科学家们更热衷于对核壳（包括多层）量子点的研究。

Wu[17]用水热法直接合成的ZnSe/ZnS核壳纳米晶粒，具有尺寸可调、窄的荧光发射波长（370–400nm）。

与单独的ZnSeQDs相比，ZnSe/ZnS核壳结构的荧光产率和稳定性都得到了很大提高。

目前，通常采用巯基类的化合物作稳定剂直接合成具有较高荧光量子产率的水溶性量子点，但是往往稳定性不好，需要进行表面修饰。

而在有机溶剂中制备的量子点，其表面含有疏水性配体，因此也需要进行表面修饰，才能用于生物分析应用。

一般修饰方法，是采用水溶性的材料取代QDs表面的疏水配体，赋予其水溶性和生物活性。

同时为实现QDs的特异性结合，需要在其表面化学修饰的基础上，定向连接生物靶向分子。

通过化学偶联、静电作用、免疫反应、链亲和素与生物素结合等方法将靶向生物分子连接到量子点表面，使其具有功能化活性，以实现抗原-抗体、受体-配体、DNA互补序列、核酸识体-靶、酶-底物等特异性识别。

其中可作生物连接剂的有酶[18]，抗体[19]，小分子结合的蛋白质[20]，寡核苷酸[21]等。

然而制备具有长期稳定性、粒径分布窄和生物相容性好的高质量的水溶性量子点并把它们应用于生物领域，仍是一个巨大的挑战。

最近报道了一些能够制备稳定性好且具有生物相容性的QDs的方法，其中用聚合物材料合成量子点成为研究的热点。

由于大多数的聚合物具有水溶性和生物相容性，因此它们在胶体化学中广泛用作分散剂、螯合剂、表面活性剂、配体等。

其中以聚乙烯醇（PVA）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为代表的聚合物，具有较好的生物相容性，它们已被广泛应用于医学、生物和制药领域。

事实上，之前已经有人使用PVA和PVP作稳定剂用于制备半导体纳米材料，但没有真正达到生物应用[22-24]。

最近的研究中，用PVP和羧酸修饰的PVP水溶液合成了CdS量子点，这是研究用羧酸修饰的PVP做配体制备CdS纳米粒子的首次报道，具体步骤见图1[25]。

图1.合成CdS-PVA胶体系统的实验步骤（a,b分别为PVA-OH,PVA-COOH的分子式）。

Fig.1.RepresentationofthedesignedexperimentalprocedurefortheCdS-PVAcolloidalsystem;（Molecularstructuresof（a）poly（vinylalcohol）PVA-OH,and（b）PVA-COOH）.

2量子点的毒性

随着制备技术的不断完善，量子点必将成为最有潜在应用价值的生物荧光标记物。

但是，由于量子点是由重金属元素组成的物质，在标记中会释放出Cd2+或Pb2+，从而对细胞组织或环境造成危害。

因此，量子点的毒性是人们研究中需要考虑的一个重要方面。

影响量子点毒性的因素有很多，包括粒径大小、溶液颜色、包覆材料、量子点用量、表面化学性质、涂层的生物活性及工艺参数等[26-28]。

量子点毒性的研究机制主要与金属离子的释放、自由基的形成、量子点与细胞内的组成部分的相互作用有关。

在量子点的表面包覆一层低毒或无毒的有机分子（如TOPO）或是无机材料（如SiO2和ZnS），可以减小其毒性，但是不能消除，特别是在紫外灯的照射下[29]。

研究发现[30]，量子点结构的不同（如：

CdSe、CdTe、ZnS–AgInS2），或是不同的表面改性（如：

甲胂酸（MAA）、纳米二氢硫辛酸（DHLA））都是是影响QDs的毒性的重要因素。

另外发现量子点的稳定性也是影响其毒性的一个重要因素。

目前QDs进入生物体后的毒性研究还是很少，以及进入机体后的稳定性、分散度、生物相容性等研究仍很匮乏，这些问题都需要作进一步的研究。

3量子点在生物检测中的应用

上世纪80年代后期，生物学家开始关注量子点在生物学方面的应用。

最初是在QDs的表面引入极性基团，应用于简单的生物大分子标记。

目前量子点已被广泛应用于生物中的分析与检测，例如荧光免疫分析，生物芯片，生物传感器，生物体内成像等等。

3.1QDs用于荧光免疫分析

免疫分析是临床医学上鉴别某些生物标志的重要生物技术手段，人类的健康与葡萄糖、尿酸、胆固醇和某些酶等重要的生理物质息息相关。

因此，对生物分子的分析方法就需要有敏感性好、成本低、能进行多组分同时检测等特点。

量子点的激发波长范围宽，单一波长光源就可以激发出不同大小的量子点，它是实现多个组分同时检测的理想标记探针。

尺寸可调的QDs可用于荧光免疫分析，使其在生物临床诊断技术检测取得了进一步的发展。

Lingerfelt等[31]用交联生物素的量子点对葡萄球菌肠毒素B进行了免疫色谱检测，这种方法的检测限最低可达10ng/mL。

Goldman等[32]用四种不同颜色的量子点分别与抗霍乱毒素、蓖麻毒素、志和菌毒素和葡萄球菌肠毒素B的抗体偶联，在一个微孔板上实现了四种毒素的多组分同时检测，这在多组分免疫检测领域是一大进步。

Freemanet[33,34]等用核酸修饰的CdSe/ZnS量子点实现了对金属Hg+和Ag+的同时检测。

然而QDs用于酶及其它重要的生理物质的检测少有报道，在最近的一次报道中，Yang等[35]的工作主要在用QDs分析乳酸脱氢酶（LDH）和葡萄糖的活性。

他们用直接在水溶液中合成的CdTeQDs建立一种生物分析平台，对人体血清中乳酸脱氢酶（LDH）和葡葡萄糖进行同时检测。

基于CdTeQDs的分析系统不仅对开启和关闭同步分析过程更加方便，而且能同时检测酶和底物。

CdTeQDs作为一个良好的电子供体或受体，当酶反应中产生的过氧化氢（H2O2）进入CdTeQDs的表面，体系迅速进行电子转移，H2O2被还原成O2。

此时QDs发生了荧光猝灭，并且随着葡萄糖浓度的增加，反应中产生更多的H2O2，荧光猝灭增强。

如果反应中只是加入葡萄糖，则不会发生荧光猝灭，由此来实现对过氧化氢和葡萄糖的分析，如图2所示。

与已建立的酶分析方法相比，该生物分析平台制备简单，对β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的依赖性酶和过氧化氢生成基质的活性分析灵敏度较高。

虽然这种基于双量子点的测定还处于发展阶段，相信该方法在临床分析的多重检测中有潜在的应用。

图2.基于QDs的电子转移和生化反应的H2O2（A）和葡萄糖（B）的检测。

Fig.2.SchematicprincipleforassayofH2O2（A）andglucose（B）basedontheelectrontransferofQDsandthebiochemicalreaction.

3.2QDs用于生物芯片

生物芯片技术在基因型的检测上具有高通量、快速、方便及试剂用量少的优点。

量子点色彩的多样性满足了对生物高分子（蛋白质、DNA、RNA等）所蕴含海量信息进行分析的要求。

但受荧光探针性能的限制，一次通常只能将一种（或很少几种）标记了荧光探针的蛋白质与芯片作用。

检测多个蛋白质，就只能进行多次上述操作。

因此，严格意义上说，这种芯片只是“单高通量”的。

Han等[36]充分利用QDs标记物独特的光学特性，巧妙地将不同荧光颜色的QDs组合后，结合到内部镂空的聚苯乙烯小球内，从而形成了具有不同荧光特性的可标记到生物大分子的微球。

这种量子点微球标记物的发射荧光强、稳定性好，而且这样的量子点微球可以编成密码用来标记不同探针，可同时搜索生物芯片中的很多靶点，为“海量”通量的实现提供了可能。

Parak等[37]用4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯（SMCC）将表面带有巯基硅烷化的QDs与氨基修饰的不同单链DNA偶联，将其与固定在玻片表面的DNA进行杂交。

在荧光显微镜观察发现：

当玻片上的DNA与QDs偶联的DNA碱基互补时，可以观察到玻片上出现荧光，不互补的则观察不到荧光信号，从而实现了更为快捷的高通量筛选。

报道[38]中使用两种探针，一种是有机荧光修饰的报告探针，另一种是生物素修饰的捕获探针。

这两种目标特异性的寡核苷酸探针与目的基因DNA进行夹心杂交后，然后被链覆盖的QDs捕获在其表面形成QDs复合物，导致单个量子点共振信号的扩大，从而可实现生物芯片对生物大分子的高通道筛选。

最近，Koji等[39]建立了一种快速、新颖的蛋白质记录材料，通过光化学技术显示出记录、阅读和删除信息。

在紫外可见光照射1min后完成记录，获得一种高时空的分辨率。

然后通过特定的蛋白质和配体的相互作用，可读出一个清晰的蛋白质排列。

最后通过在图案表面的光照辐射实现删除过程，如图3。

该技术对生物芯片的微型排列具有重要的意义，该方法不仅可用于对天然高分子如蛋白质、DNA的记录，也可用于有荧光的无机纳米材料如量子点。

图3.用固化在玻璃表面的光偶联剂合成一种光记录和可消除的蛋白质记录材料。

Fig.3.Strategyofsynthesizingaphotorecord/erasableproteinrecordingmaterialusingaphotolinkerimmobilizedonaglasssurface.

QDs已被公认为最有发展前景的蛋白质及生物分子荧光探针。

利用量子点的多重性和多强度的性质，对生物分子群进行大量编码标记，在基因组学和蛋白质组学研究中具有重要的现实意义。

生物高分子的分析过程将会集中在一个芯片上，真正实现多通道、高通量的快速、灵敏、特异性的检测，为获得细胞内生命的研究提供强有力的技术平台，这项技术会给整个生命科学带来革命性的变化。

3.4QDs用于生物传感器

生物传感器就是包含酶、抗体、细菌、组织等识别剂的生物实体，QDs独特的光电特性以及有较大有效比表面积的特点，能够提高生物标记检测灵敏度使其成为生物传感的理想研究对象。

基于高灵敏的QDs，已经成功构建出生物小分子和蛋白质的高灵敏传感器。

最近的研究表明，基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器中，量子点可以用作荧光共振能量转移技术的给体。

Medintz[40]等设计出了测量小分子基于QDs的蛋白质传感器。

在这一配置体系中，通过附有蛋白质的5-组氨酸，将麦芽糖结合蛋白与CdSe/ZnS核壳QDs进行复合。

染料标记的环糊精分子与蛋白质分子的结合使荧光淬灭，然后用加有麦芽糖的环糊精分子取代后，QDs荧光又恢复了。

正是由于QDs能与分子光谱相配的有机荧光染料组成荧光共振能量转移对，他们以发绿色荧光（560nm）的QDs标记麦芽糖结合蛋白，以有机荧光染QS-Y-9（其最大吸收在565nm）标记β-环糊精，将两者组成荧光共振能量转移对。

当有麦芽糖存在时，二者之间的能量转移过程被破坏。

而QDs的荧光得以恢复，这样就实现了对麦芽糖的均相传感。

在之前的报道中，制得的实体探针用小分子物质的识别，如三磷酸腺苷（ATP）、可卡因、蛋白质、血小板源性生长因子（PDGE）、凝血酶等[41-43]。

Levy等[44]设计了一种基于量子点的Aptamer生物传感器用来检测凝血酶，这种Aptamer传感器能改变FRET。

首先是将Aptamer修饰在量子点的表面，当Aptamer与带淬灭基团的寡核苷酸杂交反应后，QDs的荧光发生淬灭。

此时Aptamer结合凝血酶，QDs的荧光恢复，从而达到检测凝血酶的目的。

Hu[45]等报道了使用硅聚合物作为涂层合成的量子点在pH=1-14的范围有很强的稳定性。

但是由于QDs表面的硅层较厚，合成步骤复杂，不能用于高效共振能量转移中分子标灯（MB）的应用。

最近，Wu[46]等发展了简单、迅速的方法，合成了质量较好的量子点。

该QDs用硅聚合物作覆盖层，不仅具有荧光产率高、稳定性好，而且硅层较薄。

如图5把硅覆盖的QDs与具有碱基互补的MB（每个MB带一个猝灭剂）进行耦合，形成了一种灵敏度高的、选择性好的传感器。

当硅覆盖的QDs与分子标灯相连时产生荧光猝灭，此时加入与目标DNA分子，该DNA与MB进行碱基互补配对，QDs的荧光恢复，从而在15min内实现对目标DNA分子的检测。

图3.连接有MBCdSe/ZnSQDs对目标分子的检测。

Fig.3.SchematicofaCdSe/ZnSQDbasedmolecularbeaconforthedetectionoftargetmolecules.

3.3QDs用于生物体内成像

量子点的另一个潜在的应用就是作为荧光照影剂用于生物医学成像。

由于量子点的激发光谱比较宽，可用红外或近红外光对活组织进行激发,提高成像的穿透深度和灵敏度。

红外和近红外荧光QDs由于能穿透组织进行深层组织成像且自发荧光背景较低，可用于体内红外实时成像。

由于近红外光谱区（NIR:

700–1000nm）对活体组织有较低的吸收和散射，在该光谱区的荧光照影剂引起了人们较多的关注[47]，传统的NIR荧光已用于蛋白酶活性[48]、生长抑制素受体[49]、心肌血管[50]等的体内成像。

然而，组织光性能怎样影响量子点在体内的性质还尚待解决。

Lim等[51]合成了一种特殊的近红外QDs，首次报道了NIRQDs用于生物体内血管的实时成像，有助于更好的理解QDs作为荧光照影剂进入生物组织用于生物成像时，组织的吸收、散射、厚度对其荧光性能的影响。

Gao等[52]采用聚乙二醇（PEG）包覆的QDs标记前列腺特异性膜抗原（PSMA）的抗体，从小鼠尾部经静脉注射，实现了对表达PSMA前列腺癌的靶向成像。

探测了量子点在动物体内的生物分布、非特异性摄取、细胞毒性等，取得了良好的检测灵敏度和多色的能力。

这些结果为用多个生物标志物的超灵敏检测和同时成像提供了新的可能。

根据[53]报道，使用具有1〜2倍的光学分辨率的三维半导体量子点作为荧光成像，该方法可用于在450-550nm光谱范围内的共焦显微系统中。

重组的三种激子态产生蓝移的荧光即量子点这可以的三重激子成像（QDTI），与传统的量子点信号区别开来。

MeikeHeidbreder等[54]采用此方法研究蛋白质在细胞膜和亚细胞细胞器的结构及其空间组织。

证明了U373细胞的微管网状结构的三重激子成像（QDTI），在HeLa细胞膜上对肿瘤坏死因子受体2的3D成像，COS-7细胞上的线粒体细胞色素c氧化酶和肌动蛋白在的多色3D成像。

图4中为655nm标记的细胞色素c氧化酶和488nm的phalloidin–AlexaQDot标记的肌动蛋白的多色共聚焦荧光成像。

由于此新方法与生物细胞的相容性较好，因此可用于细胞结构和生物分子分布的成像。

与其它荧光染料相比，量子点能进行多细胞的标记成像，说明了QDs作为荧光标记物在生物和生物医学细胞成像中的独特优势。

图4.细胞色素c氧化酶和肌动蛋白的多色共聚焦荧光成像。

Fig.4.Multicolorconfocalfluorescenceimageofcytochromecoxidaseandactin.

4总结与展望

由于量子点技术有其独特的标记特点，它必将成为今后生物分子检测的尖端技术，为DNA检测、蛋白质检测和探索蛋白质－蛋白质之间反应原理提供更先进的方法。

同时也将极大的推动生物显像技术和生物制药技术的迅猛发展，给疾病的诊断和治疗带来巨大进步

然而量子点在生物医学应用中仍然存在一些尚未解决的问题，可以从下几个方面进行研究：

（1）设计制备简单、水溶性好、稳定性高、荧光效率高、环境友好的量子点仍然有很大发展空间。

（2）QDs的种类繁多、毒性不一、机制不同、对活体细胞的毒性较大等问题，还有待进一步研究。

（3）设计合成一些新型的巯基配体，如聚合物或生物大分子，用于量子点表面修饰以提高量子点的生物相容性。

（4）尝试把量子点与其它纳米材料的复合制备，并掺杂一些过渡金属离子（如Mn、Cu、Eu等），探索量子点更广阔的应用前景。

通过QDs制备工艺的不断完善，不断克服其不足之处，相信QDs在生物标记中的应用可以为大量多项实验和诊断学带来新的发展手段，也将会成为生物医学标记应用中一项颇具前景的新技术。

参考文献

[1]WCWChan,DJMaxwell,XHGaoetal.Curr.OpinBiotech.,2002,13:

40～46.

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497～504.

[3]AMSmith,XHGao