经济林木花芽分化的分子机理研究进展.docx

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经济林木花芽分化的分子机理研究进展

经济林木花芽分化的分子机理研究进展

1引言

开花是植物从营养生长向生殖生长转变的过程，植物生长到一定阶段便由叶芽生理和组织状态转化为花芽生理和组织状态，发育成花器官雏形，这个过程称作花芽分化［3］。

高等植物的成花是植物在生长过程中内部因子与外部因子协同作用的结果，在经过一段时间的营养生长后，植物对光照（光周期、光质、光强）、温度、水分、养分等环境因子和植物激素等内部因子产生响应，开始促使植物从营养生长转向生殖发育。

先在茎端分生组织形成花序分生组织，花序分生组织进一步形成花分生组织，继而产生花器官原基，再逐步分化成成熟的花器官，最终实现植物的开花过程［4］。

目前，草本模式植物拟南芥的开花调控模式研究取得了重大进展，但与一年生草本植物不同，多年生木本植物需要经历一个较长的幼年期，才能获得生殖成熟，即开花。

幼年期的长短取决于该物种本身的特性，从4年到20年不等（Pillitteretal.,2003）。

这一特性极大地限制了树木的遗传改良，尤其是具有重要经济价值的果树及林木的遗传改良（段艳欣等,2004）。

另外，由于多数木本植物具有较长的幼年期，使得对突变体或转基因树木的成花研究变得异常困难。

随着分子生物学和生物技术的发展，以及人们对植物开花诱导分子机理的遗传学研究深入的开展，利用生物技术进行林木的性状改良己成为传统育种的一种有效辅助手段。

目前已从木本植物中克隆出大量的与树木花发育相关的基因［2］。

在自然状态下，多数高等植物的成花存在一些明显的特点：

（l）需要经过一定时期的营养生长，达到一定的“年龄”和生长量后，才具备成花的能力，特别是一些木本植物，更是存在一个长达几年甚个十几年的童期。

影响这一过程的是一些花序分生组织和花分生组织决定基因以及上游的一些调控基因；

（2）植物的开花是“多因子”相互作用形成的［1］。

木本果树要渡过漫长的童期后，才进入成花状态：

而一旦完成了第一次成花。

以后每年都在相同的季节开花，其营养生长和生殖生长共存，果实发育或枝梢生长与次年开花的花芽诱导及发端共存，不象草本植物那样，从胚胎开始，经数个月后即进入成花状态，开花结果后通常即完成生命周期。

因此，木本果树的成花研究更为困难。

果树从叶芽转入成花过程包含基因、激素、载体、受体、细胞膜系统、促进或抑制因子等因素的相互作用[64,65]［1］。

2模式植物花芽分化分子机制研究进展

最近十余年来，利用拟南芥为模式植物，对高等植物开花时间调控机理与信号转导途径的研究取得了长足的进步。

目前我们对植物开花时间调控机制的了解主要是通过对拟南芥的遗传学研究获得的。

影响拟南芥开花时间的因素有很多，其中光照和温度是两个主要的外部因素，而赤霉素（GA）和一些自主性因子是主要的内部因素。

此外，植物的生理状况（如年龄、植株大小）、胁迫条件（如干旱、营养匮乏、拥挤、病害、极点温度）、植物激素、水杨酸、碳水化合物、维生素C、谷胱甘肽、过氧化氢、microRNA等也对开花时间产生一定的影响。

通常这多种信号汇集在一起调控顶端分生组织（shootapicalmeristem；SAM）的发育过程，这种随着内在生理条件和外界环境条件的变化而对开花时间所进行的精细调控，是拟南芥在长期进化过程中形成的一种适应性的选择优势（张素芝，左建儒.2006）［5］。

模式植物花发育的过程可分为三个阶段:

开花决定（floweringdetermination）、花的发端（flowerevoeation）和花器官的发育（floralorgandevelopment）（桂建芳等,2002）。

2.1与开花转换有关的基因

影响开花期早晚的基因被称为开花时间基因（floweringtimegene）。

通过对拟南芥突变体和不同天然生态型进行遗传分析，研究者鉴定了大量的影响开花时间的墓因位点—开花时间基因。

开花时间基因可以决定植物对日照的长度和春化作用等环境因子作出反应，它们突变以后能够使开花时间提前或延后（JacK2004）［6］。

2.1.1晚开花突变

已有13个与晚开花突变体相关没有其他多效性的基因被鉴定，它们是CO（COSTANS）、GI（GIGANTEA）、LD（LUMINIDEPENDENS）、FCA、FD、FE、FHA、FLD、FPA、FVE、FWA和FY（Koonneefetal，1991）。

根据对光周期、春化作用和对富远红光应答的反应，将迟开花突变体分成3个组:

第一组包括fca、fve、fpa、fy、ld和fld，这些突变体对环境刺激的应答大大强于野生型，春化处理几乎可以完全解除这些突变体迟开花的表型;第二组包括广括ft、fe、fwa和fd，这些突变体对光周期有强烈的应答，但对春化和富远红光反应很弱，与野生型相似;第三组包括co、gi和fha，这些于变体对长日光周期、春化以及富远红光均不反应［6］。

2.1.2早开花突变

已筛选出的没有明显多效性的早花突变体有elf1（earlyflowering1）、elf2（earlyflowering2）、emf1（embryonicflower1）、emf2（embryonicflower2）、tfl1（terminalflower1）和tfl2，这些突变的表现型为莲座叶和花序的节数减少，说明它们的野生型基因产物的功能是抑制成花转变（Sungetal.,1992）［6］。

2.2开花决定

开花决定是植物生殖生长启动的第一个阶段，决定开花时间（Wangetal.,2007）。

该阶段茎端分生组织在形态上没有变化，但在生理生化和基因表达等方面有明显的变化。

拟南芥和金鱼草等模式植物成花诱导的分子机制研究表明：

控制开花时间的基因（或位点），通过多种途径诱导，包括光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径等共同调节植物的开花转化（图1）［2］。

这四条途径主要通过调节FLOWERINGLOCUST（FT）、SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCO1（SOC1）、LEAFY（LFY）来调节成花和控制开花时间，所以这些基因的表达水平决定了开花时间的早晚（Moonetal.,2003;Blazquezetal.,2000;Onouchietal.,2000;Samachetal.,2000;Moonetal.,2005）［10］。

图1为拟南芥开花调控途径（自Komedaetal.,2004）

Fig.1ThegeneticpathwaysoffloweringinArabidopsisthaliana（fromKomedaet

al.,2004）

2.2.1光周期途径

植物体内感受光的物质是光受体,根据吸收的光谱不同将光受体分为3类：

隐花色素（cryptochromes）感受蓝光和紫外线A，光敏色素（phytochromes）感受红光和远红光,紫外光B类受体感受紫外线B。

其中光敏色素有5种：

PHYA,PHYB,PHYC,PHYD和PHYE；不同的光敏色素在相同的光照条件下，或者调节截然不同的反应，或者调节相似的反应（Khannaetal.,2006）。

例如，尽管PHYA和PHYB都介导光对苎麻下胚轴伸长的抑制作用，但PHYA主要对远红光起响应而PHYB主要对红光起响应。

另外，虽然PHYA和PHYB对于开花的抑制或诱导都不是关键的光敏色素，但它们都参与调节开花时间（Khannaetal.,2006）。

phyB突变体表现出提早开花，这表明PHYB延迟开花的时间；相反，PHYA则通过抑制成花抑制因子的合成进而促进开花。

例如，当野生型植株在黑暗时间内被光照1小时后，植株即表现为提早开花。

而phyA突变体则没有表现出这种类型。

然而，phyAphyB双突变体开花要早于phyB单突变体，这表

明两种光敏色素对开花的影响是复杂的，而且在光敏色素的信号转导过程中还存在一些调节因子。

感受蓝光信号的隐花色素（CRYPTOCHROME）也影响光形态建成。

隐花色素有两种：

CRY1和CRY2（Zhangetal.,2008）。

它们在去黄化和成花转变过程中起着重要作用（Cashmoreetal.,1999;Quail,2002）。

在去黄化作用中，CRY1一般响应强的蓝光而CRY2则对弱的蓝光有显著响应（Yuetal.,2009）。

由于光敏色素也感应蓝光，所以完全分开光敏色素介导的响应和隐花色素介导的响应是困难的。

参与植物响应日照长度的一些基因已经通过分子遗传途径得到了克隆及鉴定（Sanghoetal.,2005）。

在这些基因中，一些编码特定的参与开花调节的调节蛋白，而另外一些基因则编码光信号转导途径中的作用元件，或者参与昼夜节律生物钟的功能行使［2］。

光周期对开花模式的影响可能是：

首先是光受体,如PHYA和CRY2,感受日长和夜长,产生昼夜节律（circadianrhythm），这时光受体本身或与其有关的一些物质之间形成某种平衡，如果日长和夜长发生变化，这种平衡就会被破坏，结果会使一些促进或抑制开花的基因表达，进而启动或抑制开花进程。

CRY2是蓝光感受器，在拟南芥中促进开花（Guoetal.,1998;Liuetal.,2008a），同时也是CO（CONSTANS）的正调因子（Suarez-lopezetal.,2001）。

CO编码一个锌指蛋白，其信使RNA在长日照条件下比在短日照条件下含量要丰富的多，表明CO受长日照信号诱导（Putterilletal.,1995;Liuetal.,2008b）。

过量表达CO可促使拟南芥早花。

另外一个是红光/远红光感受器，PHYTOCHROMEB（PHYB），抑制开花。

长、短日照条件下，phyB突变体均表现早花。

实验证明，phyB突变体的早花部分地依赖于CO的作用，并且PHYB是在翻译水平上调控CO的表达（Putterilletal.,1995;Valverdeetal.,2004）。

短日照条件下植株并不表现出早花表型，是因为在依赖于长日照的开花促进途径中活跃表达的基因在短日照条件下失去了表达活性。

当然，除了光周期的影响，也可能还有其它的生理因素影响这些基因的表达。

ft突变体部分抑制了35S:

CO植株的早花表型，说明光周期途径中CO通过FT促进植物开花（Liuetal.,2008b）。

同时ft突变体抑制了35S:

CO植株中的早花表型，说明CO通过FT调节花的发育（Sanghoetal.,2005）［2］。

2.2.2春化作用途径

人们早就发现经过低温处理几周的一些植物往往会比没有处理的开花要早，这种低温处理一段时间可促使植物开花的现象称为春化作用。

春化作用的效应取决于植物本身所处的阶段、处理时间长短和所使用的温度。

根据是否需要春化来完成生命循环，可以把拟南芥分为冬一年生和多年生型；夏一年生和短生命周期型，他们分布在从北极圈附近到赤道附近的整个地球表面，这说明不同环境的植物繁衍后代策略的形成是跟环境有密切关系的，在今后这些生长发育有关的分子进化的研究将会是一个热点的领域。

人们发现植物经历了春化作用以后，FLC的表达量会一直维持在一个比较低的程度，研究表明春化效应是通过细胞有丝分裂稳定保留下来的，这说明春化作用很大程度上受到了表观遗传学机理的调控。

1998年，Finnegan等发现，春化途径有跟DNA和组蛋白的甲基化有关，经过大量的研究后指出低温会降低拟南芥体内DNA甲基化水平，春化促进开花与甲基化水平的降低有关，可能是低温诱导了对开花非常重要的基因或基因启动子的去甲基化引起的。

近年来，表观遗传学的研究的深入使人们对春化途径有了新的认识。

春化会使FLC附近染色质堆积组蛋白修饰标记，使其表达受到影响。

在春化途径中，VERNALIZATION2（VRN2）是一个果蝇聚梳蛋白家族的Su（Z）l2基因的同源基因，可能跟H3K27和H3K9的甲基化有关，在果蝇中聚梳蛋白复合体通过表观遗传学调控基因表达，在胚胎早期就已经稳定的影响基因表达，并且会伴随着果蝇以后的生长发育；在动物中，H3K9会缠绕HP1用来稳定其甲基化成果。

在拟南芥中也发现了HP1的同源基因LIKEHP1（LHP1），LHP1跟春化相关的抑制FLC途径有关；VERNALIZATION1（VRN1）编码了植物特有蛋白-基因结构域,在有丝分裂过程中会稳定并普及；VERNALIZATIONINDEPENDENT3（VIN3）是FLC乙酰化所必须的蛋白，只会在长时间的冷处理后才会表达，说明它可能是春化途径中必需的但非启动型的基因。

高表达量的FLC会使植物失去开花的能力，这发生在许多过冬拟南芥类型中，被一个显性基因FRIGIDA（FRI）控制，FRI编码了一个盘绕蛋白，可以促进FLC的表达，但是并没有证据说明它是怎样上调FLC的表达的。

在小麦和大麦中目前已鉴定出3个春化作用相关基因，小麦TaVRN1编码一种与拟南芥的AP1同源的MADS盒转录因子。

在春化需求型品种中TaVRN1表达量很低，春化处理激活其表达，进一步激活下游花分生组织基因并诱导开花（Adametal.，2007）。

小麦TaVRN2编码蛋白含有一个锌指结构域和CCT（CO，CO-Like，TOCI）结构域，是一种成花抑制因子，春化作用可以解除这种抑制，长日条件下，TaVRN2mRNA的表达呈现昼夜节律性变化，而在短日条件下则不表达。

长日条件下，TaVRN2可能通过抑制FT基因的表达而抑制开花（Yanetal.，2004;Karsaietal.，2005）。

TaVRN1能够抑制VRN2基因的表达。

VRN3编码FT的同源基因，在长日条件下促进开花（Yanetal.，2006）。

在大麦中，VRN3对开花的促进作用需要伪应答调节因子PPD-1H（PHOTOPERIOD1）的协助（Yanetal.，2006）［13］。

2.2.3自主途径

一些拟南芥的开花时间突变体在长日和短日条件下均比野生型晚开花，但对春化作用产生依赖，其对开花的调控作用独立于春化作用与光周期途径之外（Martinez-ZapaterandSomerville，1990；Koornneefetal.，1991），该信号传导途径称为自主途径。

外界环境因子对植物开花的诱导可使植物在较适宜的环境下开花，但如果缺少这种诱导，有些植物在营养生长到达一定阶段后也会开花。

至今为止在发现的众多拟南芥开花突变体中，还没有完全不开花的，这说明植物内部还存在着控制开花的自主途径。

当植物的光周期等途径受阻后，自主途径通过感受植物体内部的发育状态，并与环境信号相互作用而在不同时期促进开花。

人们将长日照和短日照下都晚花的突变体归为自主途径类突变体。

与春化途径一样，自主途径也是通过抑制FLC基因的表达来促进开花的。

在拟南芥中相继克隆到了FCA，FY，FLD，FPA，FVE，LD和FLK七个基因，研究发现自主途径的这七个基因都跟染色质修饰或RNA修饰有关，可见转录后调控可能是自主途径调控开花的一种重要调节机制（MiehaelsandAmasino,1999;Sheldonetal.,1999）。

FVE编码了一个MSI1同源基因，FLD编码了一个与赖氨酸去甲基化酶LSD1同源的基因，FVE和FLD都跟组蛋白的脱乙酰化复合体的形成有关；FCA，FPA和FLK都包涵一个可能的RNA结合结构域，另外FCA和FPA蛋白都包含了一个RNA结合结构域RRM，而FLK拥有3个KH保守结构域，而且高表达FCA基因可以逆转FRI对FLC的促进作用，从而达到开花的目的；FY和酵母菌中mRNA3′端加A的末端加工因子Pfs2p同源；LD编码了一个未知的蛋白。

以上研究暗示了自主途径可能是跟春化途径共同通过调整染色体结构（如甲基化，乙酰化等）来控制FLC的表达。

但是，这些基因的之间的关系并不是简单的加成作用：

人工构建的fca/fpa双突变体就比人们所预想的更加晚花，fpa和fy突变体综合在一起会有致死的表型。

另外，大量研究表明，这些基因不仅在开花诱导过程中起作用，而且在植物的生长发育过程中很有可能扮演了更为广泛的角色。

此外，突变体分析表明白主途径基因通过彼此独立的相互平行的途径调控FLC的表达［13］。

2.2.4赤霉素（GA）途径

赤霉素（GA，gibberillin）途径是控制开花过程的重要途径，也是控制开花过程的开花素重要组分之一（于春霞等,2006）。

短日照条件下，拟南芥由营养生长向生殖生长转变受到花的分生组织征基因LFY的正向调节，而GA能够促进LFY的表达（Blazquez,2000）。

赤霉素可能通过启动子上的类似于MYB转录因子结合位点的序列调节LFY基因的表达（Blazquez,2000）。

然而，尽管LFY基因的转录水平能够被赤霉素激活，但是35S:

:

LFYga1-3植株仍然比35S:

LFY植株产生更多的莲座叶，这表明赤霉素在调节开花时间方面还有其它的作用（Blazquezetal.,1998）。

在花粉发育过程中，花粉囊的形成与花粉小孢子的发生也依赖于GA调节部分DELLA蛋白的表达，GA是通过解除DELLA蛋白对植物开花的抑制作用从而促进植物开花的（Ludmilaetal.,2004）。

DELLA亚家族包含五个成员，分别是：

RGA,GAI,RGL1,RGL2和RGL3。

其中RGA是ga1-3的主要抑制基因；GAI与RGA具有82%的同源性，对赤霉素比较敏感；RGL1在调节花的发育方面具有一定功能。

GAI,RGA和RGL1抑制植物对内源赤霉素的响应，而外施GA则可以消除这种抑制作用。

RGL2也与花发育调节有关，不过它更重要的作用是影响拟南芥种子的萌发。

通过对几种植物RGA和GAI同源基因的研究发现：

无论是单子叶植物还是双子叶植物，在抑制GA的信号途径方面，DELLA蛋白的功能是保守的。

RGA和GAI是植物生长的主要抑制因子，RGA在赤霉素信号传递途径中主要起抑制作用（Ludmilaetal.,2004）［2］。

2.2.5成花抑制途径

有一些拟南芥突变体不形成成熟营养叶，而直接从胚胎发育转到生殖生长（Yangetal.,1995）。

有些基因的突变体加速开花转换，而有的基因在其它基因的作用下抑制开花转换，这些基因被归类为抑制遗传途径。

最早的这一类突变体是emf1（embryonicflower1）突变体，其表型非常极端：

不形成任何的莲座叶，只形成一个简单的花序和缺失花瓣、形态异常的花（Auberetal.,2001）。

接下来被鉴定的具相似表型的第二个突变体是emf2（embryonicflower2）（Yangetal.,1995），其突变是隐性突变，EMF2基因对于在胚胎发育和苗发育过程中促进营养生长抑制开花是必需的（Moonetal.,2003）。

通过对EMF2的克隆阐述了该基因的作用机制。

FRI也是一个开花抑制基因，但是它的作用只有在FLC的作用下才能够实现。

而且还抑制FCA、FPA的功能。

研究表明，FRI蛋白是FLC基因的激活因子，而且在开花转换过程中，FLC在茎端受到负调节［2］。

2.3花的发端

花的发端，即茎顶端分生组织（shootapicalmeristem，SAM）向花分生组织的转变，由花分生组织特性基因控制，这类基因在成花转变过程中被激活，控制着下游花器官特性基因和级联（cadastral）基因的表达I37）［7］。

在营养生长期，茎顶端分生组织产生叶芽，但进入开花转换期后该分生组织

首先转变为花序分生组织（inflorescencemeristem，IM），花序分生组织侧面新产生的原基即为花分生组织（floralmeristem，FM）。

花序分生组织具有非决定性，在野生型拟南芥、金鱼草中花序分生组织可保持不断的分生能力，具有无限生长的特点；而花分生组织的分化具有决定性，具有有限生长的特点。

在拟南芥中，侧面原基花分生组织同一性的获得是通过正负调节子的相互作用而获得的。

其中最主要的基因、也是了解最清楚的基因是LFY、AP1和TFL1［7］。

2.3.1茎分生组织特异基因

分生组织特异基因可以分成两个亚族：

茎分生组织特异基因（shootmeristem

identitygene）和花分生组织特异基因（floralmeristemidentitygene）。

茎分生组织特异基因如TFL1，其作用是保持茎花序顶端分生组织的未决定性，抑制花原基的分化[38〕。

在tfl1突变体拟南芥中，茎分生组织转变为花分生组织，花序芽转变为单花，而不是发育为无限花序[39]。

此外，tfl1突变体的花期提前，说明了TFL1是一个开花抑制子[40，41]。

Ratcliffe等研究表明：

在35S启动子驱动下，TFL1的组成型表达引起转基因植株各个发育阶段的延长，产生一具有大量叶片的增大莲座和一具有许多侧生枝的长的花序茎，并最终形成正常的花，揭示着TFL1具有延迟茎顶端相转变的作用[42]。

TFL1强烈表达于茎花序分生组织，在花分生组织中没有表达。

TFL1的表达模式正好与花分生组织特异基因LFY和AP1的表达模式互补，这两个基因在花分生组织有表达，而在花序分生组织中没有表达。

TFL1通过抑制花分生组织特异基因在花序先端的表达从而阻止花序分生组织转变为花分生组织，因此在tfl1突变体中，LFY和APl表达范围扩大至花序分生组织，导致这些花序分生组织转变为花[32，43]［7］。

TFLI属于磷脂酞乙醇胺结合蛋白同源蛋白（phosphatidylethanolaminebinding

proteins，PEBPs）[32，44]，该蛋白家族还存在于动物、酵母和细菌中，在控制生长和分化的信号转导过程中发挥作用［45-47]。

TFL1属于一个小基因家族[48]，FT也属于该基因家族，在核仁中通过与bZIP因子结合形成复合物发挥促进开花的作用。

但是与TFL1不同的是，FT的突变作用表现为花期推迟，35S:

FT转基因植物表型与tfl1突变体相似[49]。

Ahn等通过氨基酸替换，使TFL转变为FT，反过来FT也可以转换成TFL，说明这两个蛋白质的生化功能是相似的［50］［7］。

Ratcliffe等的研究还发现：

LFY和AP1具有阻止TFL1在花分生组织中表达的作用［42］。

与TFL1抑制开花功能相一致的是，TFL1低水平表达于茎营养分生组织中。

TFL1在茎顶端分生组织中的表达水平增加时间与成花转变时间一致，TFL1表达水平增加是成花转变的早期标志之一[32]［7］。

除了TFL外，EMBRYONICFLOWER（EMF）基因也起着抑制花分生组织特异基因表达的作用，其突变体不经过营养生长而直接由胚发育转变为生殖生长[51］。

只有当EMF低水平表达时，LFY才会表达，即EMF协同TFL1对LFY基因的表达起着负调节作用[52]［7］。

2.3.2花分生组织特异基因

在拟南芥中，花分生组织特异基因如LFY和AP1的作用是使花序分生组织侧面形成的原基发育为花，而不是叶芽。

lfy和ap1单突变体表型为花向叶芽的部分转变[32，53]；lfyap1双重突变体表型与35S:

TFL1表型相似，侧面分生组织形成枝芽，而不是花[32]，说明LFY和AP1的作用是控制茎向花的转变。

这两个花分生组织特异基因中，LFY的作用尤为重要，其强突变体基部花芽完全转变为枝芽，顶花