普通光学显微镜的使用单染色及革兰氏染色.docx

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普通光学显微镜的使用单染色及革兰氏染色

【实验题目】

欧阳光明（2021.03.07）

普通光学显微镜的使用，单染色及革兰氏染色

【实验目的】

1.学习并掌握显微镜的结构功能和使用。

2.学习微生物涂片、染色的基本技术。

3.学习掌握革兰氏染色法。

4.初步认识细菌的显微形态。

【实验器材】

1、菌种：

金黄色葡萄球菌（G+）、大肠杆菌（G-）、枯草芽孢杆菌以及自选菌种两种

2、溶液和试剂：

a）草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及碘液、95%乙醇、无菌水等

b）香柏油、二甲苯

3、仪器及其它用品：

普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿等

【实验原理】

A、普通显微镜的基本原理

1、基本原理

现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来昂达成像，故又称为复式显微镜。

它们包括机械部分和光学部分两部分。

机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。

光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。

显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。

所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。

要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。

显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。

2、油镜微生物学使用的显微镜的物镜通常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔的不是一层空气（干燥系），而是一层油脂，称为“油浸系”。

由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。

镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）

图2介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较

B、简单染色的原理

细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。

利用单一染料对菌体进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构的方法叫做简单染色。

此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

染色前必须固定细菌，其目的有二：

一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；

二是增加其对染料的亲和力。

常用的有加热和化学固定两种方法。

固定时尽量维持细胞原有的形态。

C、革兰氏染色的基本原理

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：

染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：

碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。

脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G和G-两大类群，常用的复染液是番红。

经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。

G+G-

1）G＋菌：

细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。

呈紫色。

2）Gˉ菌：

肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

【实验内容及步骤】

A显微镜的使用方法

1、安放

右手握住镜臂，左手托住镜座，使镜体保持直立。

桌面要清洁、平稳，要打开实验台上的灯光。

2、低倍镜观察

先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动调光旋钮（可变电压调节旋钮），调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。

3、高倍镜观察

显微镜的设计一般是共焦点的。

低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。

4、油浸镜观察

油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。

使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。

当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。

载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。

显微镜有自动止降装置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。

没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。

使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。

油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。

无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。

B简单染色

1、流程图：

、

2、具体步骤：

1）洗片、干燥

取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。

干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。

方便以后水洗染料，避免洗去细菌。

2）涂片

取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多，但是大肠杆菌较小，为短杆状，可适当多取）；

3）干燥与固定

涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；

4）染色

将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1-2min

5）水洗

倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；

6）干燥

用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；

7）镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。

c）革兰氏染色

1、流程图：

2、重要步骤：

1）洗片、干燥

取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。

干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。

方便以后水洗染料，避免洗去细菌。

2）涂片

在标记的载玻片一侧分别滴加半滴无菌水。

分别取6种活跃生长期菌种（金黄色葡萄球菌，大肠杆菌

（1），大肠杆菌

（2），枯草芽孢杆菌，自选菌

（1），自选菌

（2））按常规方法涂片（不宜过厚）。

3）加热、固定

用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对6种菌进行干燥和固定。

4）初染

滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min后水洗；

5）媒染

先用碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗；

6）脱色

先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗；

7）复染

先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染2min后水洗；

8）镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。

分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果。

【结果分析】

1、实验图示

金色球葡萄球菌大肠杆菌

（1）大肠杆菌

（2）

枯草杆菌自选菌

（1）自选菌

（2）

革兰氏染色结果

金黄色葡萄球菌大肠杆菌

（1）

大肠杆菌

（2）枯草芽孢杆菌

自选菌

（1）自选菌

（2）

2、实验结果

革兰氏染色结果

菌种名称

菌体颜色

细菌形态

结果（革兰氏阴性/阳性）

金黄色葡萄球菌

蓝色

球状

阳性

大肠杆菌

（1）

淡红色

短杆状

阴性

大肠杆菌

（2）

红色

短杆状

阴性

枯草芽孢杆菌

蓝色

杆状

阳性

自选菌

（1）

蓝色

球状

阳性

自选菌

（2）

蓝色

球状

阳性

3、实验结果分析

本次实验通过对简单染色及革兰氏染色的学习使我们对革兰氏染色的原理及操作步骤有了初步的认识。

而且实验结果让我们对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的外部形态以及革兰氏阳性与阴性有了一个初步的了解。

并且可以通过自己对未知菌进行革兰氏染色来判断其细胞壁的性质及结构。

实验结果表明，金黄色葡萄球菌为一般聚集成团，大肠杆菌为椭圆状短杆菌而枯草芽孢杆菌为双杆菌，同时他们分别为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

自选菌革兰氏染色呈紫色，可初步断定其为阳性菌，其细胞形态和金黄色葡萄球菌极为相似，可能为金黄色葡萄球菌。

【思考与讨论】

1、革兰氏染色是否成功。

有哪些问题需要注意？

A、滴在载物板上的水滴滴加时应用点滴法，避免水滴过大占用空间，难以干燥并且可能造成不同编号之间造成交叉污染。

B、加热干燥时，应用手背试温，避免因为温度过高烧干细菌，导致细菌细胞形态发生显著变化，影响观察。

C、在进行染色是应当严格控制时间，酒精脱色时间不宜过长，否则易造成假阴性。

D、在冲洗结晶紫，碘液，95%乙醇、番红的时候，应采用缓慢的水流冲洗载玻片背部，是水流分支冲洗正面即可，不可用水流直接冲洗载玻片正面。

E、冲洗染料的程度为：

沿载玻片边缘流下的水滴呈无色即可。

F、在加入碘液媒染、酒精脱色时，应当先用相应试剂冲洗载玻片正面，防止玻片上的水将试剂稀释，再用试剂覆盖细菌，开始计时。

2、现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，如何鉴定它是革兰氏阳性还是阴性，如何确定你的染色结果的正确性？

可以进行革兰氏染色的对照实验。

将已知的革兰氏阳性菌--金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌--大肠杆菌以及未知杆菌在同一张玻片上进行涂片与革兰氏染色，对照未知菌体的染色情况，从而判断出它是革兰氏阳性/阴性。

3、为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？

若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌呈现阴性反应，在显微镜下出现假阴性现象。

4、你认为革兰氏染色中哪个步骤可以省略？

在何种情况下可以省略？

复染可以省略，在已知它是阳性菌还是阴性菌的情况下可以省略。