棉花组织培养的研究.docx
《棉花组织培养的研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《棉花组织培养的研究.docx（14页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
棉花组织培养的研究
分类号：
学校代码：
学号：
南京晓庄学院本科生毕业论文
棉花组织培养的研究
ThestudyonTissuCultureofCotton
所在院（系）：
学生姓名：
指导教师：
研究起止日期：
二○○八年九月至二○○九年五月
二○○九年六月
学位论文独创性声明
本人郑重声明：
1.坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。
2.本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。
3.本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。
4.本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。
5.其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。
作者签名：
日期：
棉花组织培养的研究
作者：
指导老师：
摘 要:
以珂字棉312品种为材料,探讨了培养基成分对顶芽培养、茎尖培养、下胚轴愈伤组织和胚性愈伤组织诱导的影响。
结果表明,在含有0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LKT培养基上下胚轴愈伤组织诱导效果很好;在含有MS+0.5mg/LIBA+蔗糖3%培养基上顶芽存活率和生根率较高；使用SH培养基，可提高直接诱导胚性愈伤的频；在含有0.5mg/LIAA+0.5mg/LKT的SH培养基上胚性愈伤组织的诱导频率较高，虽然诱导率仅有13.3%，但这种方法操作简单，周期短。
关键词：
珂字棉312;愈伤组织诱导;胚性愈伤组织
ThestudyonTissuCultureofCotton
Author:
Supervisor:
Abstract:
Effectsofvariousmediaonbud,shoottip,callusandembryogeniccalluswerestudiedfromCoker312.Theresultsindicatedthatthemediumwith2,4-D0.1mgLandIAA0.1mgLwasbetterthanotherhormonecombinationsforinitiationofcallusfromhypocotyls.HighersurvivalandrootingrateofbudwereachievedonthemediumcontainingMS,IBA0.5mg/Lansucrose3%.TheinductionrateofembryogeniccalluswasraisedontheSHmedium.HigherinductionratesofembryogeniccalluswereachievedonthemediumcontainingIAA0.5mg/LandKT0.5mg/L.However,therateofInductionwasonly13.3%,themethodwassimpleandthecyclewasshort.
Keywords:
Coker312;callusinduced;Embryogeniccallus;
目录
引言4
1 材料与方法5
1．1 试验材料5
1．2 培养基5
1.3试验方法5
1.3.1无菌苗的获得5
1.3.2顶芽制备6
1.3.3茎尖分生组织制备6
1.3.4愈伤组织的诱导6
1．3.5直接诱导胚性愈伤6
2结果与分析6
2.1种子的灭菌的效果6
2．2培养基成分对棉花苗顶芽生长和生根的影响7
2.3培养基成分对棉花茎尖生长的影响8
2．4不同激素浓度配比对愈伤的诱导9
2．5愈伤组织生长分化过程的观察9
2.6不同激素浓度对胚性愈伤诱导的影响10
3讨论11
致谢12
参考文献12
引言
棉花是我国主要的经济作物之一，棉花生产的兴衰对于国民经济的发展具有重要意义。
随着基因工程和分子生物学的发展，以转基因技术和分子选择技术为核心的现代育种，能够实现作物设计育种，将外源有益基因导入受体植物细胞，并使其定向而稳定地遗传。
小麦、玉米、水稻、大豆、番茄等作物的基因工程都取得了很大的进展。
目前转基因的方法很多，在棉花的遗传转化中应用的主要有基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法，其中前两种方法都需要建立基因转移的受体系统。
建立高效而稳定的植物遗传转化体系，是保证植物转基因获得大量可供筛选群体的前提条件。
因此，只有不断地优化棉花体细胞胚胎发生和植株再生体系，才能有效的发挥基因遗传转化在棉花现代育种中的作用。
棉花一直被公认为是植株再生最困难的植物之一，棉花组织和细胞培养落后于其它植物。
虽然棉花体细胞组织培养经过20多年的发展，在一些实验室已基本建立了陆地棉植株再生体系，但与其他作物相比，棉花体细胞胚胎发生,存在周期长、胚发生率低、畸形苗多、生根困难等[3-4]限制因子。
Davidonis等[1]报道陆地棉子叶愈伤组织在改良Linsmaier和Skoog[2]培养基上继代培养2年后得到第一株再生植株，标志着棉花组织培养体系初步建立起来。
随后，一系列的棉花体细胞胚胎发生的成功报道涌现出来,但在大多数获得的再生材料均含有珂字棉、岱字棉血统,基因型限制一直是困扰棉花体细胞培养及遗传转化广泛开展的绊脚石。
近几年，棉花组织培养又获得了新的发展，Mishra[3]等报道了多个珂字棉品种的再生；Sakhanokho等[4]首次报道了亚洲棉植株再生；Wu等[5]利用多阶段调控手段获得了多个长江流域难再生基因型棉花品种再生植株；Sun等利用不同浓度的激素组合、不同碳源对多个野生棉进行体细胞胚胎发生调控，获得了5个野生棉的再生植株，并将其用于棉花原生质体及体细胞杂交研究，使该领域的研究达到国际先进水平。
尽管如此，研究的重点仍然是在体细胞胚胎的诱导方面，而对体细胞胚胎的萌发以及植株再生移栽的关注力度不够，导致棉花试管苗移栽存活率低下，最终影响到植株再生的效率。
张家明等[6]建立了一个较易获得再生植株的技术程序和试管苗移栽的技术方法。
张家明等研究发现具有胚胎发生能力的品种具有严格的地域性限制，黄河流域品种比长江流域品种容易获得再生植株。
随着棉花基因工程的广泛开展，对棉花组织培养提出了更高的要求，主要表现在要求获得大量的不同T2DNA插入位点的转基因植株，从中筛选外源基因高效表达的转化植株，避免因为多拷贝入、位置效应、DNA甲基化等因素导致的转基因沉默，这就要求棉花组织培养技术能够获得大量的发育正常的再生植株。
目前关于棉花转基因再生植株的有效成苗技术报道尚不多。
但在2007年谢德意等[7]以棉花的胚性愈伤组织作受体材料，用农杆菌介导的遗传转化方法,将含有植株衰老期特异表达启动子的ipt基因导入4个陆地棉品种，研究了不同基因型品种的转化效率，建立了有效的转基因再生植株成苗、移栽技术体系。
在做棉花的组织培养这个实验前，我参阅了大量关于棉花组织培养方面的文献材料，在指导老师的帮助下，主要进行了以下几个方面的工作：
（1）棉花无菌苗最适条件的研究；
（2）无菌苗的获得；（3）不同培养基成分对棉花苗顶芽生长和生根影响的探讨；（4）不同培养基对茎尖生长的影响；（5）愈伤组织的诱导；（6）直接诱导胚性愈伤组织。
研究棉花的组织培养一方面为棉花的再生提供了理论基础；另一方面虽然现代基因工程技术很发达，为培养各种新奇的植物品种提供了可能，但是在基因工程育种过程中，不论是用基因枪，还是通过农杆菌介导的转基因,都需要细胞的脱分化、再分化等过程，本试验以棉花下胚轴为外植体,诱导愈伤组织，并探索了不同培养基成分对顶芽生长、茎尖生长、愈伤组织诱导和不定芽诱导的影响，为初步建立高效的再生体系奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
选取棉花种子无菌苗的顶芽、茎尖、下胚轴为外植体材料。
1.2培养基
获取无菌苗培养基：
MS基本培养基：
由MS大量元素、MS微量元素与B5维生素组成，蔗糖3%，
琼脂5g/L；
顶芽生长和生根培养基：
1/4MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%；1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%；MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%；MS+IBA0.5mg/L+蔗糖6%；MS+IBA0.5mg/L+葡萄糖3%，添加琼脂粉5g/L；
茎尖生长培养基：
MS+IAA0.2mg/L+KT0.2mg/L+蔗糖3%；MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%MS+IBA0.5mg/L+KT0.2mg/L+蔗糖3%；MS+IBA0.5mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖6%，添加琼脂粉5g/L；
诱导愈伤组织培养基：
MS＋2,4-D0.1mg/L＋KT0.1mg/L；MS＋IAA1.0mg/L＋KT0.1mg/L；MS＋IAA2.0mg/L＋KT0.1mg/L；MS＋IAA4.0mg/L＋KT0.1mg/L，添加葡萄糖3%，琼脂粉5g/L；
直接诱导胚性愈伤培养基：
MS+2,4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L;MS+IAA1.0mg/L+KT0.lmg/L;
MS+IAA4.0mg/L+KT0.lmg/L；MS+IAA4.0mg/L+KT0.lmg/L，添加葡萄糖3%，琼脂5g/L；
培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整PH值至5.8。
1．3实验方法
1.3.1无菌苗的获得
珂字棉201、312、冀668种子经过以下几种处理（见表1），播种接于无激素的MS培养基上，在25～28℃培养、光照500～2000lx下培养，每天光照16小时。
表1不同灭菌方法的灭菌效果
Table1Theeffectofdisinfectionfordifferentsterilizations
编号处理步骤
S170%酒精灭菌3min→30%H2O2灭菌10min→去壳→70%酒精灭菌30S→30%H2O2灭菌5min
S270%酒精灭菌3min→30%H2O2灭菌10min→去壳→70%酒精灭菌30S→15%H2O2灭7min
S370%酒精灭菌3min→30%H2O2灭菌1h→无菌水浸泡24h→去壳
1.3.2顶芽制备
选取2～3d无菌苗[8],棉花无菌苗切去下部留下2-3厘米长度，接种在顶芽生长培养基上，在25～28℃培养、光照500～2000lx下培养，每天光照16小时，2周后观察顶芽的生长情况。
1.3.3茎尖分生组织制备
选取5d珂字棉312无菌苗[9],切去下部留下2-3厘米长度，在解剖镜下小心剥去棉花叶片及幼叶露出生长点，并保留适当2～3cm长度下胚轴，接种10d后观察并统计结果。
1.3.4愈伤组织的诱导
选取基本培养基MS上生长的大约5天苗龄的棉花无菌苗为试材[10,11]。
在无菌操作台上，取下胚轴[2,3]部位切成大约3～4mm,接种到诱导愈伤组织培养基里，每瓶接种5段下胚轴,每种培养基各接种5瓶,做3次重复，置于培养温度25℃,光照强度2000～3000lx,每天光照14h，定期观察并拍照。
诱导率=产生愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100%
1．3.5直接诱导胚性愈伤
选取7d无菌苗，切取下胚轴，接种到直接诱导胚性愈伤组织培养基上，在25℃培养、光照2000lx下培养,6周后观察并统计结果。
2结果与分析
2.1种子的灭菌的效果
由表2可知，S2和S3灭菌方法下污染率和对出芽率的影响都很小；S1灭菌方法相对较差，而对操作的难易程度而言S2灭菌方法较易操作。
不同种子在同一中灭菌方法下的污染率和出芽率不同，由此可见种子自身情况起到最重要的原因。
表2不同灭菌方法对不同种子的影响
Table2Effectsofvarioussterilizationmethodsonthevariousseeds
种子灭菌方法接种瓶数污染瓶数未被污染出芽个数污染率出芽率
（瓶）（瓶）个数（个）（个）（%）（%）
珂字棉312S1102403820.0095.00
S2101454310.0095.55
S3101454320.0095.55
珂字棉201S1103353230.0091.43
S2101454310.0095.55
S3101454310.0095.55
冀668S1105252250.0088.00
S2103353130.0088.57
S3103504430.0088.00
2.2培养基成分对棉花苗顶芽生长和生根的影响
由表3可知：
不同培养基配方对棉花苗顶芽存活和生根情况有很大的影响。
通过1、2、3号培养基比较，得到不同浓度的基础培养基MS对棉花苗顶芽生长影响不同，随着MS的浓度减少存活率下降幅度很大，由100.0%降到最低为7.7%，但生根率却提高了，达到了100.0%，则应在配方中使用1份的MS最好；通过3号很5号培养基的比较，可见以蔗糖作为碳源时比葡萄糖对顶芽的生长好;通过3号和4好培养基的比较，随着蔗糖浓度的增加存活率下降，但生根率提高，则选用蔗糖6%，可见4号培养基配方更有利于棉花苗顶芽生长和生根，其次是3好培养基，但再从顶芽长势上看3好培养基的长势最好，4号和5号培养基中叶片发黄，综上可见，3号培养基是最有利棉花苗顶芽生长和生根的。
表3不同培养基对棉花苗顶芽生长和生根的影响
Table3Effectofvariousmediaonthesomaticbudgrowthandrhizogenesisofcottonseedling
培养基培养基配方接种苗数存活顶芽数存活率生根苗数生根率
编号（个）（个）（%）（个）（%）
11/4MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%1218.312100.0
21/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%1317.71100.0
3MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%1212100.0866.7
4MS+IBA0.5mg/L+蔗糖6%121083.310100.0
5MS+IBA0.5mg/L+葡萄糖3%9888.9562.5
图1顶芽试管苗
Fig.1Tubeseedlingofsomaticbud
2.3培养基成分对棉花茎尖生长的影响
所选用各激素组合对棉花茎尖培养的影响如表4所示。
实验结果表明,单独使用0.5mg/LIBA对茎尖的生长具有明显的促进作用。
茎尖的出芽率高达100.0%，达两片真叶率有80.0%，而随着KT量的增多使成芽率很达两片真叶率都出现大幅度下降。
表4不同培养基对棉花茎尖生长的影响
Table4Effectofvariousmediaonthesomaticapicalmeristemofcotton
培养基配方接种外植成芽数成芽率达2张达两片真
基础激素组合（mg/L）蔗糖含量体数（个）（个）（%）真叶苗数叶率
成分IAAIBAKT（%）（个）（%）
MS0.20.23211990.5526.3
MS0.531010100.0880.0
MS0.50.2399100.0222.2
MS0.51.06201470.0321.4
2.4不同激素浓度配比对愈伤的诱导
由表5可知：
不同激素组合对下胚轴诱导出愈的频率不同，愈伤组织的形态特征差异较大，含有2，4-D0.1mg/L、KT0.1mg/L培养基中，下胚轴产生的愈伤组织的频率很高，基本上达到100.0%以上，形态基本都是松软的，且生长量远远高于IAA与KT的组合。
表5不同激素浓度及配比对棉花愈伤组织诱导效率的影响
Table5Effectofvarioushormonesoncallusformationandinductionofembryogeniccallifromcottonhypocotyls
品种培养基愈伤组织诱导
基础激素组合（mg/L）时间接种数出愈率质地颜色生长速度
成分2,4-DIAAKT（d）（个）（%）
珂字棉312MS0.10.13025100.0松软灰色快
1.00.l302596.4疏松淡黄色中
2.00.l302595.3疏松、坚硬深绿色慢
4.00.l302584.7坚硬白色极慢
珂字棉201MS0.10.13025100.0松软灰色快
1.00.l302596.1疏松淡黄色中
2.00.l302594.6疏松、坚硬深绿色慢
4.00.l302585.3坚硬白色极慢
冀668MS0.10.12530100.0疏松灰、淡黄快
1.00.l255096.0松软黄褐中
2.00.l253390.9坚硬白、绿慢
4.00.l253083.3疏松黄褐快
2．5愈伤组织生长分化过程的观察
3个品种下胚轴切段在诱导培养基上都能形成愈伤组织，从颜色看有三种灰色、黄白色、深绿色，主要可分两种类型的愈伤组织：
一类（如图2B）是淡黄色或灰色的疏松组织主要体积大、胞壁薄、连接疏松的圆形、椭圆形和长形细胞组成；另一类（如图2D）是深绿色或黄白色的坚硬愈伤组织，主要体积小、胞壁厚、连接紧密的多边形细胞组成。
灰色的愈伤组织较易得到胚性愈伤组织,黄白色的愈伤组织较差,深绿色愈伤组织不能得到胚性愈伤组织[12]。
可见不同类型的愈伤组织的胚性愈伤组织的诱导频率不同。
下胚轴切段2天后可见表皮切口处变褐，4d后茎段两端开始变粗、膨大（如图2A），7d后出现肉眼可见愈伤组织且伴有根的发生（如图3）,一般是愈伤组织生长量多则不定根少。
愈伤组织诱导初期胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织已同时存在,只是胚性愈伤组织量较少[13]。
20d后产生大量愈伤组织（如图2B）。
30d以后是愈伤组织鲜重增加的高峰期（如图2C）。
50d以后逐渐减慢,60d后愈伤组织的鲜重基本不再增加。
在观察期间发现部分愈伤组织在生长一段时间后出现不定根，推断在棉花下胚轴离体培养中不定根的发生有下列3种情况[14,15,17]:
一是由维管组织结节中扁平状分生细胞分化而来,这在某种程度上（如发生部位）类似于活体条件下侧根的发生；二是在愈伤组织内直接分化根原基,这种形式较为普遍；三是由单个分生细胞团单极性生长,直接发育而来。
A
B
D
C
图2下胚轴愈伤组织状况
Fig2Statusofcallusofhypocotyle
A珂字棉312培养4天的愈伤组织；B珂字棉312培养20天的愈伤组织（2,4-D/KT激素组合诱导的愈伤组织callusinducedwith2,4-D/KTcombinations.）；C珂字棉312培养30天的愈伤组织；D珂字棉312培养20天的愈伤组织
图3不定根
Fig3Adventitiousroot
2.6不同激素浓度对胚性愈伤诱导的影响
由表6可知：
在1号培养基上（IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L）,产生胚性出愈率是最高的，达到13.3%；其次是2号培养基，再其次为3号培养基，最少的是4号培养基配方，仅有2.2%。
单独使用KT则可高效直接诱导获得胚性愈伤组织,但其浓度之间也有所差别,其中以0.5mg/L的用量较佳；IAA的添加虽然可提高棉花愈伤组织的诱导率和诱导量,但却削弱了KT对棉花胚性愈伤组织的诱导效果。
表6不同激素浓度对胚性愈伤诱导的影响
Table6Effectofdifferentconcentrationofhormonesontheinductionofembryoniccalluses
编号基础激素组合（mg/L）接种外植体数产生胚性愈伤数胚性岀愈率
成分IAAKT（个）（个）（%）
1SH[10]0.50.5901213.3
2SH1.00.590910.0
3SH2.00.59055.5
4SH4.00.59022.2
3讨论
激素及其组成是影响棉花下胚轴直接诱导胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的主要因素。
由表5不难看出,2,4-D的添加可诱导形成大量的愈伤组织,一些研究结果表明，添加大量2,4-D不利于胚胎发生的直接诱导[17,18]。
在本实验中凡添加2,4-D的培养基均能诱导获得大量愈伤组织；同时也是影响愈伤组织形态的主要原因。
由图2可见，愈伤组织从形态上分可分为两种：
一类（如图2B）是淡黄色或灰色的疏松组织主要体积大、胞壁薄、连接疏松的圆形、椭圆形和长形细胞组成；另一类（如图2D）是深绿色或黄白色的坚硬愈伤组织，主要体积小、胞壁厚、连接紧密的多边形细胞组成。
不同培养基配方对棉花苗顶芽存活和生根情况有很大的影响.在本实验中通过对培养基中MS含量、碳源、激素三个方面探讨了对顶芽生长和生根情况，发现配方MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%这个配方最适合顶芽生长和生根，在此培养基中顶芽的存活率最高达100.0%，生根率达66.7%，虽不是最高，但植株长势是最好的，所以MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%为最佳配方。
非胚性愈伤组织的形成抑制了胚性愈伤组织的形成,在本实验中直接诱导获得胚性愈伤组织的外植体诱导率都不高，最高为13.3%。
根的分化似乎与胚性愈伤组织的形成有一定的关系,在本实验中诱导获得胚性愈伤组织的下胚轴均或多或少地分化出一些根,而没分化出根的外植体均没能诱导获得胚性愈伤组织；但也不是所有能分化出根的外植体均能诱导获得胚性愈伤组织。
造成这种现象的原因可能与根的分化影响了外植体中内源激素的浓度变化有关,但还需进行有关研究。
致谢
本论文是在导师蔡小宁讲师的精心指导下完成的。
在此首先向蔡老师表示我深深的感谢和最诚挚的敬意。
蔡老师学识渊博、勤奋敬业、诲人不倦，特别是对科学孜孜以求的态度，严谨求实的工作作风以及奋勇前进的进取精神让我受益匪浅，终生难忘。
在攻读学位的几年中，在生活、学习、蔡老师为我创造了宽松的环境，在论文完成的各个阶段始终得到了蔡老师的关心与鼓励，在此谨向辛勤培育我的老师致以衷心的感谢和崇高的敬意。
参考文献：
[1]DavidonisGH,Hamiliton
升级会员 