植物生理学中各项生理指标的测定方法.docx

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植物生理学中各项生理指标的测定方法

植物生理学中各项生理指标的测定方法

一.实验内容

实验1MDA(丙二醛)含量测定所需试剂:

10%三氯乙酸(TCA)(纯)0.25%硫代巴妥酸(纯)实验2:

可溶性蛋白含量测定所需试剂:

考马斯亮蓝G-25095%乙醇85%磷酸实验3:

SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂:

dl-甲硫氨酸(Met)NBTEDTA-Na2核黄素实验4:

CAT(过氧化氢酶)活性(过氧化氢酶)测定所需试剂:

PBS(PH=7.0)30%H2O2

实验五:

Ap某(抗坏血酸过氧化物酶)活性(即ASA—POD活性)测定所需试剂:

ASA(分子量167.12)(乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2PBS(pH7.0)30%H2O实验6:

ASA(维生素C)含量测定

偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二联吡啶FeCl3(或FeCl3·6H2O)

实验7:

GSH(谷胱甘肽,媚力肽GSHGSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂:

NaH2PO4·2H2ODTNB(二硫代硝基苯甲酸)PBS(PH6.8)实验8:

脯氨酸测定所需试剂:

磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸85%磷酸试验9:

叶绿素含量测定。

80%丙酮试验9:

GR活性测定

试验10:

过氧化氢含量测定。

三氯乙酸

试验11:

超氧阴离子含量测定

二.酶液和母液提取

1.酶液提取所需试剂:

50mmol/L磷酸缓冲液(PH=7.8)(内含1%(m/v)聚乙烯吡哆烷酮PVP),0.1mmol/LEDTANa2或EDTA),也可为(内含2%(m/v)PVP),0.2mmol/LEDTANa2或EDTA)(先配制后用缓冲液定容)

2.ASA.GSH母液提取所需试剂:

5%偏磷酸

1.抗氧化酶酶液提取(SOD.POD.CAT):

1g(根据样品的量,少的可以适当减少)叶片加入预冷5ml.50mmol/L磷酸缓冲液(PH=7.8)

4℃冷冻15000g离心20分钟

上清液即为酶液(5℃下保存一两天内备用,中短期用-20℃保存)

2.ASA.GSH母液提取:

0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液

4℃冷冻14000g离心10分钟

上清液即为母液(5℃下保存备用)(偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA)

酶液提取所需试剂:

PVP(聚乙烯吡哆烷酮):

1%(1g溶于100ml水),1000ml需称取10g,此处用PBSEDTA-Na2:

0.1mmol/L(37.2mgEDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水),此处用PBS

PBS(缓冲液)配制方法:

①Na2HPO4·12H2O②NaH2PO4·2H2O

取①71.64g,蒸馏水定容至1L,取②31.21g定容至1L,放置4℃冰箱备用PH=7.8取①91.5ml+②8.5ml=100ml(浓度0.2mol/L)

需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml(0.2mol/L某0.1=0.05mol/L某V)

母液提取所需试剂:

5%偏磷酸:

称5g纯偏磷酸,定容至100ml蒸馏水(需加热溶解,温度在50-60℃)偏磷酸有剧毒(偏磷酸难溶解,先得用研钵提前研碎,后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容)(现所用为38%HPO3,所以需称65.7895g,定容至500ml)

三.实验步骤

实验1:

MDA含量测定

1.1所需试剂:

10%三氯乙酸(TCA)(纯)称10g定容至100ml

0.25%硫代巴妥酸(纯)称0.25g用10%TCA定容至100ml

(配制时,可一次完成,先配TCA,不要定容,再加入硫代巴比妥酸,然后定容,若难溶解,可以在磁力搅拌器上微热)

1.2步骤:

取0.3g叶片,加4ml磷酸缓冲液研磨,

加入4ml0.25%的硫代巴比妥酸(溶于10%的三氯乙酸)溶液

↓摇匀95℃加热15分钟

↓快速冷却

3000g离心15分钟↓

取上清测定OD532,OD600,OD450值↓

按公式求MDA浓度=6.45某(OD532-OD600)-0.56OD450(μmol/L)

可溶性糖浓度=11.71某OD450(mmol/L)

-3

最后计算MDA含量(μmol/gFW)=[4某(MDA浓度某)某10/0.1]

-3

同时,可测得可溶性糖含量(mmol/gFW)=4某(可溶性糖浓度χ)某10/0.1

(用多波长测定,在测定之前一定要矫正基线,公式中的参数可以直接在分光光度计上输入)注意:

以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进

1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量,用量可以定为1.0、1.5或2.0(较好)ml。

2.硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代巴比妥酸(溶于20%的三氯乙酸)溶液。

实验2:

可溶性蛋白含量

(参照Bradford方法测定),以BSA作为标准蛋白(牛血清蛋白)2.1所需试剂及配制:

牛血清蛋白(BSA),考马斯亮蓝G-250,95%乙醇,85%磷酸考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂的配制:

称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml95%乙醇,加入100ml85%的磷酸,最后蒸馏水定容到1L,混匀,放置过夜,过滤后贮放在棕色瓶中,常温下可放置一个月。

●标准曲线制作:

①标准溶液配制:

称取10mg牛血清蛋白标准液,溶于蒸馏水,定容至100ml,制成100μg/ml的标准液,4℃下保存备用。

(必须是牛血清蛋白向水中溶解,不能颠倒)②取6支具塞试管(10ml),按下表配制含0-100μg/ml的牛血清蛋白液各1ml(★调零管)

★123456

)020*********

2

③各试管加入5mlG-250染色剂,翻转混合,放置2分钟,595nm比色,绘制过原点标准曲线(方程式)。

(相关系数要两个9以上)

2.2步骤:

①标准曲线(参考邹琦)(595nm比色)

注意:

制作通过原点的标准曲线,以含0μg蛋白质液调零

②取0.1g样品,加5ml蒸馏水提取,5000g离心10分钟,取上清1ml测定

③1ml样液+5mlG-250液盖塞翻转混合数次,最后595nm比色,直接从标准曲线读含量。

(此方法反应十分迅速,2分钟即达到平衡,其结合物在室温下1小时内保持稳定)

实验3:

SOD酶活性

3.1步骤:

1.取50μl酶液

①加入2ml39mmol/L甲硫氨酸(Met)②2ml0.225mmol/LNBT,(氮蓝四唑)

③1ml0.6mmol/LEDTA-Na2(①②③可以配制在一个试剂瓶里)④1ml0.012mmol/L核黄素,摇匀。

(现配现用)2.(人工培养箱内)4000Lχ日光灯下放置30分钟后,温度控制在30℃,于暗处终止反应。

(用大烧杯套着小烧杯,将试管放在同心圆内,每隔5min转过90度,转四次。

对照(不加酶液)每次至少对称地放3支,调零的不照光和不加酶液)

3.560nm处测吸光值,酶活性以抑制NBT光反应50%为一个酶活单位表示。

(实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后,一次加入5ml,然后依次加入核黄素和酶液,以不加酶液的照光管为对照。

)3.2所需试剂:

dl-甲硫氨酸(Met)39mmol/L1.1638g/200ml

均以50mmol/L

NBT0.225mmol/L(0.01840克)/100ml0.0368g/200ml

PBS配置EDTA-Na20.6mmol/L0.0223g/100ml

核黄素0.012mmol/L0.0045g/L或0.0045g/100ml用时稀释10倍PH=7.8

各试剂溶液均在用前配置,配置好后均应避光保存,尤其是核黄素,必须随用随配,避光保存。

试验进行时一次性加5ml的反应混合液配置方法:

Met+NBT+EDTA-Na2200mll+200ml+100mlSOD酶测定时,酶液量50μl偏少,改为100μl为佳,另外反应时间30分钟过长,改为20分钟适合。

SOD活性(酶单位u/gFW)=(A0-A1)某V/A0某0.5某FW某aA0---对照照光管光吸收值;A1---样品管光吸收值。

V---样液总体积(ml)5mlFW---鲜重(g)1ga---测定用样品的量(ml)0.1ml

实验4:

CAT活性(过氧化氢酶)

4.1所需试剂:

①PBS(PH=7.0)50mmol/L(61份50mmol/lNa2HPO4,39份50mmol/lNaH2PO4)②15mmol/LH2O2(以30%H2O2配)

(取85.2μL30%H2O2,以50mmol/LPBS((PH7.0)定容至100ml)4.2步骤:

1.3ml50mmol/LPBS(PH7.0)加入50μl酶液

(加比色杯的盖子摇2-3下,让酶液与缓冲液充分分散)

再加入5μl15mmol/LH2O2摇匀(加比色杯的盖子摇2-3下,让酶液与缓冲液充分分散)。

2.240nm处作时间扫描(每0.5分钟测1次,共测3分钟)3.CAT活性以每分钟消耗1μmol的H2O2为一个酶活单位。

活性计算改动:

(以每分钟OD值减少0.01为一个酶活单位u)(2005和2006年均是按OD值减少0.01算的)(以每分钟OD值减少0.1为一个酶活单位u)

3

注意:

以PBS作空白调零50mmol/L

实验5:

AP某活性(抗坏血酸过氧化物酶)(即ASA—POD活性)

5.1所需试剂:

ASA(分子量167.12)0.3mmol=0.052836(g)

(乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2(以PBS配成0.1mmol/L=0.0372(g)/L)50mmol/LPBS(pH7.0)

9mmol/LH2O2(以30%H2O2配制)(51μl30%H2O2定容至100ml)

计算为:

K1=2.8,K2=3,K3=-1,K4=100

可得到总取样(5ml酶液或1g样)的最终活性。

酶活性单位为μmol/g(鲜重)·min

以后AP某活性测定可参考沈文飚:

抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨3ml反应液中含50mmol/LPBS,pH7.0,0.1mmol/LEDTA(或EDTA—Na2),0.1mmol/LH2O2,0.5(或0.3)mmol/LAA,最后加入适量酶液(20、50、100ul均可)启动反应,连续记录测定室温下290nm吸收值的变化。

以不加H2O2作为对照,H2O2本身对AA的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽略不计。

室温下每分钟氧化1umolAA的酶量作为一个酶活性单位(U)(吸光系数为2.8mmol/Lcm)5.2步骤:

1.配反应液(50mmol/LPBS(pH7.0),内含0.1mmol/LEDTA—Na2,含0.3mmol/LASA)2.样品池加入3ml反应液,加入50μl酶液,最后加入5μl9mmol/LH2O2(盖上比色杯的盖子摇匀,2—3次)

在290nm处作时间扫描,每10秒测一次,共测30秒。

(注意:

在测定中消光值应该是不断减小的)3.根据OD290值变化,计算单位时间内AA消耗量,(ASA氧化消耗量按消光系数2.8mmol/L·cm。

),酶活性以单位时间每消耗1μmol的ASA为一个酶活单位,最后计算样品的AP某活性(单位为:

U/g(鲜重)·min)。

(活性计算改动)根据OD290值变化,计算单位时间内AA减少量(ASA氧化量按消光系2.8mmol/L·cm),并计算样品AP某终活性。

酶活性单位为μmol/g(鲜重)·min

实验6ASA含量测定

6.1步骤:

1.取样品母液0.2ml,1.4ml,75mmol/lNaH2PO4溶液(pH值7.4)(2.34gNaH2PO4·2H2O定容至200ml,用NaOH将pH调至7.4)混合;(75mmol/lNaH2PO4溶液亦可用150mmol/lNaH2PO4溶液稀释1倍得到)2.依次加入

(1)10%偏磷酸(26.3158g38%偏磷酸定容至100ml)0.4ml;

(2)44%磷酸(26ml85%磷酸+41ml蒸馏水)0.4ml;

(3)4%2,2’----二联吡啶(称取4.0g2,2-二联吡啶用70%酒精定容至100ml)0.4ml;70%酒精配制(95%乙醇70份重量+蒸馏水25份重量)

3%FeCl30.2ml(称取5.0gFeCl3·6H2O定容至100ml),摇匀,于37℃保温1.0h(5)测525nm波长下的光吸收值

4.以标准曲线方程计算ASA含量6.2标准曲线的制作:

4

方程。

实验7:

GSH含量测定

7.1步骤:

1.取样品母液0.2ml,加入150mmol/LNaH2PO4溶液(pH7.7)(11.70gNaH2PO4·2H2O定容至500ml用氢氧化钠调pH至7.7)2.6ml

2.混匀再加入0.2mlDTNB溶液(=硫代硝基苯甲酸DTNB75.3mg溶于30ml0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.8)摇匀。

[实际配置时,称75.3某2=150.6mg,即0.1506gDTNB溶于60mlPBS中]3.在30℃保温5分钟,测定412nm波长下的光吸收值。

【有些文献(如龚吉蕊、於丙军)方法同样用DTNB显色,都是在常温下显色30分钟因此可将反应时间适当延长至10分钟】

7.2根据标准曲线(GSH)方程,计算GSH含量。

标准曲线制作:

NaH2PO4(150mmol/L)→称23.41gNaH2PO4·2H2O定容至1L(或称5.85定容至250ml)DTNB(二硫代硝基苯甲酸)0.1mol/LPBS(PH6.8)(参照邹琦的书)

实验8:

脯氨酸测定

8.1步骤:

1.取0.5g叶片,用5ml3%磺基水扬酸溶液提取,匀浆液在沸水浴浸提10分钟,冷却后,以3000g离心10分钟,上清液待测。

2.取2ml待测液,加入2ml蒸馏水,再加入2ml冰乙酸和4ml2.5%茚三酮溶液,置沸水溶显色60min,冷却后,加入4ml甲苯充分振荡提取红色物后,静置后,取甲苯相(将移液枪的量程调至3.0ml吸取甲苯相,注意不要将枪伸到水相中。

)测定520nm,波长处的吸收值,依据标准曲线计算含量。

8.2标准曲线制作:

1.标准液配制;准确称取25mg脯氨酸,用蒸馏水溶解后定容至250ml,其浓度为100μg/ml,再取10ml此液,蒸馏水定容至100ml,即为10μg·ml-1的脯氨酸标准液。

(脯氨酸标准液最好现用现配,放在冰箱也易变性)

)024********

5

3.置沸水浴中显色60min。

冷却后(以后步骤同前)依据测定值绘制造原点标准曲线(以脯含量为0的试管作空白调零)为方程。

8.3所需试剂:

★3%磺基水杨酸水溶液(称3g磺基水杨酸,蒸馏水定容至100ml)★甲苯★85%磷酸★冰乙酸

★2.5%酸性茚三酮显色液称取2.5g茚三酮,加入60ml冰乙酸和40ml6.0mol/L磷酸。

贮于棕色瓶,4℃下2~3日有效。

实际配置时,需称10g,配制400ml(其中冰乙酸240ml,磷酸160ml6mol/L磷酸液(40.8ml85%磷酸定容至100ml)实际配制时81.6ml定容至200ml(68ml85%磷酸定容至1升,为1mol/L的磷酸液)

实验9过氧化氢(H2O2)含量测定方法:

参考以下文献:

张峰,杨颖丽,何文亮等:

盐胁迫过程中抗坏血酸对植物的保护功能。

西北植物学报2004龚吉蕊等:

干旱胁迫下几种荒漠植物植物抗氧化能力的比较研究。

西北植物学报2004

9.1步骤:

取0.5g叶片,加入预冷3%的三氯乙酸(TCA)研磨,12000g离心20min,取1mL上清加入等体积10mmol/l磷酸缓冲液,pH7.0,和2mL1mol/L的KI,摇匀,390nm测吸光值.

结果以ng·g-1;FwG表示L用溶3%的三氯乙酸的H2O2,50~200ng/mL,作标准曲线

实验10超氧阴离子测定方法:

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