果糖及低聚果糖的分离 纯化.docx

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果糖及低聚果糖的分离纯化

果糖及低聚果糖的分离、纯化之宇文皓月创作

一、除杂2

二、脱色2

1.活性炭脱色2

2.新生态碳酸钙法脱色2

3.树脂脱色2

3.1LSA-8吸附树脂2

3.2D318树脂2

4.离子交换2

三、提纯3

1．分子量分歧的糖的分离3

1.1纳滤分离3

1.2分级纳滤分离3

1.3柱层析凝胶分离4

2.相同分子量的糖的分离4

2.1葡萄糖和果糖的分离4

2.1.1化学试剂法4

2.1.2吸附分离4

2.1.3GOD-CAT双酶法氧化5

2.1.4复盐法5

2.1.5连续色谱分离（CSEP）5

3.手性拆分6

3.1分子印迹聚合物分离手性分子6

3.1.1功能单体的选择6

3.1.2MIPs的制备6

3.2手性膜拆分法7

3.3优先结晶方法7

3.4化学拆分法8

3.4.1生成非对应异构体拆分法8

3.4.2生物化学拆分法8

参考文献9

一、除杂

1.通过低温下冷冻和用乙醇-正己烷除去油脂和脂类物质；

2.加入磷酸和氢氧化钙，絮凝沉淀出果胶；

3.用盐析法、等电点法、溶剂沉淀法（sevage法）除去蛋白质；

4.加淀粉酶除去淀粉；

5.用阳离子聚丙烯酞胺吸附溶液中带负电荷的部分如蛋白质、多糖、蹂质、树胶、淀粉和单宁等，最佳条件52℃，pH=6，CPAM添加量为0.08%，絮凝时间3h.

二、脱色

1.活性炭脱色

通过极差最优化分析，确定出最佳影响因素pH>脱色温度>脱色时间>活性炭用量，最优化工艺条件为:

活性炭用量1.4%，脱色温度70℃，pH值3.8，脱色时间50min.【1】经试验验证的透光率为99.7%，同时在实验过程中用高效液相色谱方法检测活性炭脱色后的低聚果糖溶液中低聚果糖含量，结果显示低聚果糖在脱色前后并没有损失.

2.新生态碳酸钙法脱色

在低聚果糖液中加入Ca（OH）2混合均匀后，再缓慢通入CO2来反应生成碳酸钙，这时新生态碳酸钙便与低聚果糖液中的色素发生吸附作用，从而达到脱色的效果.在原样液锤度:

190Bx透光率:

92.31%，pH值:

6.4电导率:

26mV的条件下，测试结果不如活性炭.【1】

3.树脂脱色

3.1LSA-8吸附树脂

在温度为70℃，pH为6的条件下用脱色2h，实验结果色素的吸附率高达92.35%；【14】

3.2D318树脂

树脂用量为低聚果糖样品溶液的3.7%，pH=5.2，脱色时间3h，脱色温度为52℃.

4.离子交换

钟振声等选择了D392大孔阴离子交换树脂对大豆低聚糖进行脱色，在与低聚糖比为1:

11的条件下，常温脱色3-4小时，色素的吸附率达86%.【14】

三、提纯

低聚果糖溶液中非有效成分葡萄糖、果糖、蔗糖，其相对分子质量分别为180，180，342；有效成分蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的相对分子量分别为504，666，828.

1．分子量分歧的糖的分离

1.1纳滤分离

最佳条件：

跨膜压差为1.1MPa，料液浓度为10g/100g，温度40℃，循环流量6L/min，pH=6.【13】物料初始浓度30g/L、操纵压力0.2Mpa、纯化15倍.【12】

1.2分级纳滤分离

先将样品通过0.3微米的微滤膜，将其透过液作为分级纳滤的母液.【1】采取全回流方式，对样品共进行两级纳滤膜分离处理和一次反渗透膜回收处理.第一级纳滤膜分离，在0.3MPa，25℃，初始料液浓度为10倍稀释下，选用JN1812-34纳滤膜，对原始料液进行分离，之后三倍洗脱，截留蔗果五糖；第二级纳滤膜分离，在0.4MPa，25℃下，选用DK1812C-47D纳滤膜，对一级纳滤的透过液进行分离，截留蔗果三糖与蔗果四糖；经过两级纳滤和反渗透分离，可以将低聚果糖溶液按其所含溶质的分歧分为三部分，分别>800部分为蔗果五糖、200^800部分为低聚果糖和<200部分为葡萄糖、果糖及部分蔗糖混合物.最后对二级透过液进行反渗透膜过滤，回收其中的葡萄糖、果糖等成分和大量的水.工艺流程图如下：

为了防止因膜污染而造成的实验误差，每处理完一次样品后，均用蒸馏水对纳滤装置和纳滤膜进行3次清洗，每次清洗时间约为8min.如果长时间（大于一周）应该先用浓度为2%的概况活性剂进行清洗，最后用蒸馏水冲洗至无泡沫为止.将清洗干净的膜管保管在0.5%的甲醛溶液或1%的亚硫酸氢钠溶液中，以防止长霉长菌，损坏膜概况层.实验证明，冲洗时间和浸泡时间分别为60min和90min时二者都可使膜的纯水透过通量恢复系数达到100%左右.【13】

1.3柱层析凝胶分离

吸取一定量低聚果糖（过0.45微米的膜）均匀滴加在层析柱聚丙烯酞胺凝胶概况，打开底部阀门，待低聚果糖刚好渗入凝胶时关闭阀门，用少量的脱气超纯水洗下残留在柱壁上的糖液，打开阀门让洗脱液刚好渗入凝胶概况后关闭.接上泵开始洗脱，同时将柱下端接在蒸发光散射检测器（N2流速为2.5L/min，温度为100℃）上直接进行检测分析.【1】

在1.6cm*100cm的玻璃柱上最佳的层析条件:

洗脱速度02mL/min上样量0.5mI_（样液质量浓度0.4g/ml）、柱温40℃，以Megaz]aae公司的尺度品为对照，经HPLC和MS分析，证明层析分离所得组分峰4峰、3和峰2分别是蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。

而且经HPLC面积归一化法定量分析，证明分离产品蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖蔗和果六糖的含量分别为99.9%、99.94%、99.33%和97.89%。

【17】

2.相同分子量的糖的分离

2.1葡萄糖和果糖的分离

2.1.1化学试剂法

取混合物少许于洁净的试管中，然后滴入澄清的石灰水，振荡，不久有沉淀出现.化学反应式如下：

C6H12O6（葡萄糖）+Ca（OH）2→C6H12O6•Ca（OH）2（葡萄糖化钙）

C6H12O6（果糖）+Ca（OH）2+H20→C6H12O6•Ca（OH）2•H20↓（果糖化钙）

把上述浊液进行过滤，取沉淀于盛有少量水的试管中，然后通入CO2，又有沉淀出现.

CO2+C6H12O6•Ca（OH）2•H20→CaC03↓+C6H12O6+2H20

过滤后将滤液蒸发、结晶，即得果糖晶体.

在上面滤出的葡萄糖化钙溶液中通入CO2，同样有沉淀出现.

CO2+C6H12O6•Ca（OH）2→CaC03↓+C6H12O6+2H20

过滤后将滤液蒸发、结晶，即得葡萄糖晶体.【3】

2.1.2吸附分离

2.1.2.1聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂

吸附分离柱为一根直径为8mm，长为400mm带有恒温夹套的玻璃柱.柱内填充经Ca2+离子交换后的聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂，先吸取一定量的糖液，从吸附柱上方以一定的速度滴入，待糖液加完后，继续用同样的速度加蒸馏水将糖份洗脱，整个加入液体的速度控制在与吸附柱流出液的速度近乎相等为宜，以坚持液面位置及柱内液体流速恒定.在加完糖样同时开始在吸附柱下端收集流出液.【15】温度控制为（34.8-35.2），洗脱液为去离子水最佳分离条件为：

进样质量分数10.5%、进样体积5m1，洗脱速率0.282mL/min，在分离时间达到100min左右时，流出液中果糖含量可达90%（干基）.【5】

2.1.2.2模拟移动床（SMB）技术

SMB是一种利用色谱吸附分离原理进行液体操纵的设备.它以逆流连续操纵方式，通过变换固定床吸附设备的物料进出口位置，发生相当于吸附剂连续向下移动，而物料连续向上移动的效果.吸附塔内的吸附剂对果糖的滞留作用远大于葡萄糖.当精制后的糖液进入装有吸附剂的吸附塔后，果糖被吸附，而葡萄糖不被吸附，在解吸剂的作用下．葡萄糖与解吸剂先从吸附塔一端流出，而果糖与解吸剂最后流出，除去解吸剂，得到果糖和葡萄糖，达到分离的目的.为了连续高效地分离，若干吸附塔串联，各部分进、出料口接上管线通过分配系统，经多通旋转分配阀定时同时向前逐一切换，以实现连续分离.经过SMB的分离操纵后所得产品的果糖含量高达90%.【7】

2.1.3GOD-CAT双酶法氧化

在葡萄糖氧化酶的催化作用下把葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢，形成的过氧化氢被过氧化氢酶作用放出1/2O2，供反应体系的需要.反应过程中，加入氢氧化钙调整反应pH值，使发生的葡萄糖酸与钙离子结合生成葡萄糖酸钙，再结晶，经过分离纯化即可制得葡萄糖酸钙.这样就可将水解液中的葡萄糖和果糖分离.反应方程式如下：

最佳工艺条件:

反应温度35℃，pH5.5，酶用量GOD85u/g葡萄糖，CAT1235u/g葡萄糖，底物浓度20%（w/v），反应20h.【9】

2.1.4复盐法

混合糖液与氯化钙作用，生成果糖一CaCl2的复盐，或与NaCl作用生成葡萄糖-NaCl的复盐，然后使其自母液中分离.【7】

2.1.5连续色谱分离（CSEP）

用泵向树脂柱进料，进料液浓度为50.54g/100g，pH值4.0，体积68m1，进料结束立即泵入去离子水，操纵温度60℃，进料、洗脱流速为7m1/min.收集流出液.驻留时间为20min，在20min内进料340m1，洗脱水量735m1，洗脱回填量535m1，再吸附区回填量495m1.由检测结果知，洗脱液（果糖产品）的纯度为98.64%，果糖浓度39.29%，葡萄糖产品中的葡萄糖纯度为98.58%，果糖提取收率98.35%.图中慢流出产品为果糖产品，快流出产品为葡萄糖产品，洗脱剂为去离子水，吸附剂为树脂.【7】

3.手性拆分

3.1分子印迹聚合物分离手性分子

分子印迹技术主要在聚合过程中引入模板分子（包含原子、离子、分子、复合物或分子、离子、大分子的聚集体），通过模板分子与功能单体结合形成结合位点，交联后将模板分子固定在聚合物中，随后除去部分或者全部模板分子，形成孔穴，通过识别位点与分子印迹孔穴的共同作用来识别模板分子.采取该技术制备的聚合物通常称为分子印迹聚合物（MIPs）.【8】

3.1.1功能单体的选择

果糖中含有醇羟基，为弱酸性基团，易于与碱性功能单体形成氢键作用.因此选择弱碱性的丙烯酞胺（AM）和2一乙烯毗咙（2-VP）两种功能单体来制备MIPs.利用1HNMR研究功能单体与模板分子通过氢键作用后醇羟基质子化学位移的变更，确定分子上的醇羟基能够与功能单体发生氢键作用.

3.1.2MIPs的制备

在5OmL的两口烧瓶中加入一定量的模板分子，再加入适量乙腈作为致孔剂.加入一定比例的功能单体，超声通氮排氧，于冰水浴中预聚合8h.再加入EDMA交联剂和引发剂.之后超声1-2min，通氮气10min除氧，置于60℃水浴中聚合12h.聚合反应后得到的白色固体经粉碎、研磨、过筛，取粒径为20一60微米之间的颗粒，用丙酮沉降三次，除去过小的颗粒，于60℃下真空干燥后备用.

将真空干燥后的MIPs以干法添加到HPLC色谱柱中.装入MIPs的总量约为0.8g.以MIPs作为高效液相色谱固定相，拆分果糖的外消旋体.

3.2手性膜拆分法

用于手性拆分的支撑液膜是将膜液（溶剂和手性选择剂）通过毛细管力吸附在多孔固体膜（液体的支撑膜）的孔道中，这种液膜也可称为浸渍式液膜。

在支撑液膜（SLM）中，具有手性选择能力的载体溶解于一定的液体溶剂之中，通过与某个对映异构体特异性的结合，将其从上相运输到下相，从而实现手性分离.分离果糖的D,L构型，可测验考试酒石酸等手性选择剂。

Hadik等用基于多孔聚丙烯中空纤维膜的支撑液膜研究了D，L乳酸的拆分.作为手性选择剂的N-3，5一二硝基苯甲酰基-L-丙氨酸-辛酯溶解在疏水的液膜（甲苯）中，整个溶液固定在多孔聚丙烯中空纤维膜的孔中，最终将D,L-乳酸分开.【11】

3.3优先结晶方法

也叫接种结晶拆分法，在饱和或过饱和的外消旋体溶液中加入一个对映异构体的晶种，使该对映异构体稍稍过量因而造成分歧错误称环境，这样旋光性与该晶种相同的异构体就会从溶液中结晶出来.【10】对于不生成外消旋混合物的化合物，将其转化成盐，接种结晶拆分法工艺简单，成本较低目，效果较好;但通常只能间歇生产，一次收率较低。

【18】

3.4化学拆分法

3.4.1生成非对应异构体拆分法

该法利用手性试剂与外消旋体反应，生成两个非对映异构体，再利用它们物理性质（如溶解度、蒸汽压、吸收系统等）的分歧，将其拆分，最后再把这两个非对映异构体分别复原为原来的对映体。

通常拆分碱性物质用酸性拆分剂，拆分酸性物质用碱性拆分剂。

【18】经常使用的拆分剂有嗅化樟脑磺酸、α-苯基乙胺、酒石酸等。

YamadaS.等用嗅化樟脑磺酸作为拆分剂，对DL一P一HPG进行拆分，多次循环D一HPG的最终收率可达92%。

此法反应步调长、收率低，通常拆分剂价格昂贵，关键是选择好拆分剂，使其达到使用周期长、回收容易的目的。

3.4.2生物化学拆分法

某些微生物和霉菌在外消旋体的稀溶液中生长时，破坏其中一种对映体的速度比另一种快。

例如酵母在DL-氨基酸中，易与L一对映体反应而剩下D一对映体，从而达到拆分的目的。

生物化学拆分法可用完整的微生物细胞或从微生物中提取酶作为生物催化剂。

生物催化剂的区域立体选择性强、反应条件温和、操纵简便、成本较低、公害少，且能够完成一些化学方法难以完成的反应。

但是生物拆分法也有菌种筛选困难、酶制剂不容易保管、产品后处理工作量大以及通常只能得到一种对映体等缺点。

Yokozeki等以醛为原料，经Bucherer:

反应合成DL一5一对羟基苯乙内酞脲，然后用恶臭假单胞菌的二氢嘧啶酶催化选择性水解为N一氨甲酞一D一HPG，再经化学或酶法脱氨甲酰基得D-HPC，收率达92%。

【18】

参考文献

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（1）.