HPLC使用.docx

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HPLC使用

Waters 600E-2487 HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程

1.目的

规范Waters高效液相色谱系统的使用和维护。

2.范围

本规程适用于Waters高效液相色谱系统的使用和维护。

3.职责

质检室仪器分析员负责Waters高效液相色谱系统的日常使用和维护。

4.系统组成

本系统由Waters600E多溶剂输送系统（有梯度控制器的高压输液泵）、Waters在线脱气机、Rheodyne7725i手动进样阀、Waters2487双通道紫外检测器、Millennium32色谱工作站/电脑等组成，另外还包括打印机、UPS和通风柜等辅助设备。

5.程序

5.1.准备

5.1.1.使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用0.45μm滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。

5.1.2.通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

5.2.开机和泵操作

5.2.1.开机

5.2.1.1.接通UPS的电源，依次打开断电保护器、脱气机、600E泵、2487检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。

5.2.1.2.打开Millennium32软件，按「Login...」，输入用户名和密码，按「OK」注册进入系统主界面。

在Project档内选择所需的项目，右击『RunSamples』图标，选择色谱系统“600_2487”后打开QuickSet窗口。

5.2.2.更换溶剂

5.2.2.1.打开600E泵后，转动进口集合管阀手柄（以下简称手柄）至RUN位置；

5.2.2.2.将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂，向右打开参照阀（断开柱和进样器）；

5.2.2.3.按［Direct］键使其显示直接控制屏幕，设流速为1ml/min（梯度配比阀在0ml/min时不工作）；

5.2.2.4.选择欲使用的某一溶剂通道，设其比例为100%，其它为0%；

5.2.2.5.将输液管从原有溶剂瓶中取出，放入一干净的空瓶中；

5.2.2.6.逆时钟转动手柄至DRAW位置，用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂；

5.2.2.7.再将输液管放入新溶剂瓶内，继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止；

5.2.2.8.转动手柄至RUN位置，将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。

5.2.2.9.重复5.2.2.4.~5.2.2.8.直至所有即将使用的溶剂更换完毕。

5.2.3.排气泡

5.2.3.1.打开参照阀，换流动相为100%超纯水，设流速为10ml/min（注意：

确认参照阀是打开的，否则可能损坏安装好的柱）；

5.2.3.2.转动进口集合管阀手柄至DRAW位置，用启动注射器抽出约10ml水；

5.2.3.3.顺时钟转动手柄至INJ位置，缓慢用力使水通过泵头从参照阀出口管排出（注意不要将气泡注入泵中）；

5.2.3.4.按［Stopflow］屏幕键停泵，关上参照阀。

5.2.3.5.如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下泵出口管，用塑料管连接至塑料烧杯中，设流速为10ml/min，冲洗2~5min（或更长时间）后停泵，重新接上柱。

5.3.平衡系统（分两种情况进行）

5.3.1.等度模式

5.3.1.1.每次以0.1ml/min的增量加大流速至1ml/min，以超纯水冲洗系统10min。

5.3.1.2.检查管路连接、柱接口及泵头处是否漏液，如漏液应予以排除。

5.3.1.3.观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应在平均值的5~10%以内。

如超出此范围，可初步判断为柱前管路仍有气泡，重复5.2.3.下的步骤。

5.3.1.4.压力波动平稳后，换检验方法规定的流动相比例冲洗系统。

在检查基线稳定性前，让最少5~6倍柱体积的流动相通过系统。

5.3.1.5.在QuickSet窗口下的InstrumentMethod档内选择所需的仪器方法，按「Monitor」（此后泵由软件控制），观察基线和压力变化。

如果冲洗至基线漂移<10-3Au/min，噪声为10-4Au数量级，且压力平稳时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。

5.3.1.6.按「Abort」图标（左上第五个），停止监视基线。

5.3.2.梯度模式

5.3.2.1.按检验方法规定的条件冲洗平衡系统，并注意压力波动变化和排气泡。

5.3.2.2.在进样前运行1~2次空白梯度。

5.4.进样

5.4.1.在QuickSet窗口内左下部选〈Single〉标签，在SampleName档内填写试样名称；在Function档内选择试样类型（标准选“InjectStandards”；样品选“InjectSamples”）；在MethodSet档内选择所需的方法组；在InjectionVolume档内输入进样体积；在RunTime档内输入记录时间。

5.4.2.用针头滤器过滤试样溶液（注射液可不必过滤），用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量。

5.4.2.1.如按部分装液法，用微量注射器定容进样时，进样量应不大于定量环体积的50%，并要求每次进样体积准确、相同；

5.4.2.2.如按完全装液法，用定量环定容进样时，进样量应不小于定量环体积的3倍（5~10倍准确性更佳）。

5.4.3.按〈Single〉标签内右边的进样（Inject）按钮，等待窗口底部状态档内显示“Waiting”后，方可进样。

5.4.4.将进样阀手柄转动至Load位置，将注射器针完全插入进样阀入口中，平稳地注入试样溶液，除另有规定外，让注射器留在进样阀上，将进样阀手柄快速转动至Inject位置，系统将自动运行，采集数据并记录图谱。

5.4.5.让进样阀手柄保持在Inject位置，到下次进样前1~2min切换回Load位置，将注射器从进样阀中拔出。

5.4.6.先用水再用试样溶液清洗注射器后，按以上程序继续进样，直至完成。

5.5.数据处理（外标法）和打印

5.5.1.右击系统主界面下的『BrowseProject』图标，选择相应的项目，按「OK」进入Project窗口，选〈Channels〉标签。

5.5.2.建立处理方法　选择一个待积分的标准，右击后选“Review”进入Review窗口。

按「ProcessingMethodWizard」图标（左边第一个）进入NewProcessingMethod向导窗口，按「OK」。

5.5.2.1.划入一个感兴趣的最窄的峰，按「Next>」；

5.5.2.2.划入一段包含噪声的基线，按「Next>」；

5.5.2.3.划入一段要积分的区间，按「Next>」；

5.5.2.4.根据情况选择最小峰面积和最小峰高，按「Next>」、「Next>」；

5.5.2.5.在Name档内输入各组分峰的名称，按「Next>」、「Next>」；

5.5.2.6.在MethodName档内填写方法名称，按「Finish」。

退出Review窗口。

5.5.3.修改标准　选中所有标准，右击后选“AlterSample”进入AlterSample窗口。

5.5.3.1.在SampleType档内将Unknown改成Standard；

5.5.3.2.按「Amount」图标（左上第六个）进入ComponentEditor窗口；

5.5.3.3.按「CopyfromProcessMethod」图标（左上第五个），选择刚建立的处理方法，按「Open」，在Value和Units档内分别输入标准所含各组分的数值和单位，完成后按「OK」回到AlterSample窗口；

5.5.3.4.按「Save」图标存盘，退出AlterSample窗口。

5.5.4.积分　先选中所有标准，再选中所有未知样品，右击后选“Process”进入BackgroundProcessing&Reporting窗口，选Usespecifiedprocessingmethods，在右边档内选择刚建立的处理方法，按「OK」。

5.5.5.打印　在Project窗口下选〈Results〉标签。

5.5.5.1.选中要打印的标准/样品，右击后选“Preview”进入OpenReportMethod窗口，选合适的打印方法，按「OK」进入ReportPublisher（Preview）窗口，预览打印的结果。

按打印（Print）图标（左上第二个）即可打印结果。

5.5.5.2.按「Close」可进入ReportPublisher窗口对报告方法进行修改，完成后按「Print」图标（右数第二个）即可打印结果。

5.5.6.数据处理完成后，关闭所有窗口，在主界面下按「Logout」退出系统，关闭Millennium32软件，再依次关闭电脑主机、显示器、打印机。

5.6.清洗系统和关机

5.6.1.数据采集完毕后，关闭检测器，继续以工作流动相冲洗10min后，换水冲洗。

5.6.2.清洗进样阀

5.6.2.1.用启动注射器吸10ml超纯水；

5.6.2.2.将注射针导入口冲洗头（Rheodyne部件号7125-054）连接到注射器出口上（不要针），并将它们一起接到进样口上；

5.6.2.3.使进样阀保持在Inject位置，慢慢将水推入，水将通过注射针导入口、引导管、注射针导入管和注射针密封圈，由样品溢出管排出。

5.6.3.清洗柱

5.6.3.1.C18柱先用超纯水以1ml/min冲洗40min以上，再用甲醇或乙腈冲洗20min。

5.6.3.2.ProteinPAK60柱先用超纯水冲洗90min以上，再用甲醇或乙腈冲洗40min。

5.6.4.用水冲洗柱后，分别用20ml超纯水冲洗柱塞杆外部和法兰盘上小孔。

5.6.5.清洗完成后，先将流速降到0，再依次关闭泵、脱气机、UPS，断开电源。

5.6.6.填写使用记录。

高效液相色谱仪（Agilent1100）操作注意事项

流动相：

1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；

2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；

3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；

A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。

样品：

1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；

2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；

手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；色谱柱：

1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；

2、使用符合要求的流动相；

3、使用保护柱；

4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；

6、不要高压冲洗柱子；

7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；

使用过程中注意轻拿轻放。

操作过程：

1、开机操作：

（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开BootpServer（一般启动时已打开）；

（2）、自上而下打开个组件电源，BootpServer里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开Online）；

（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；

（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；

（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。

2、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；

3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；

4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；

5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；

6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。

冲洗过程中关闭D灯、W灯；

7、关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；

8、使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。

未经操作培训，不得擅自使用仪器。

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常见故障排除：

1、操作过程若发现压力很小，则可能管件连接有漏，注意检查。

当出现错误警告（各组件指示灯均为红色），一般为漏液，其中一个感应器中已有溶剂，漏液故障排除后，擦干，点击Online操作界面中的Instrument/SystemOff，然后再点击操作界面中的Instrument/SystemOn即可。

2、连接柱子与管线时，应注意拧紧螺丝的力度，过度用力可导致连接螺丝断裂。

柱接头处易发生漏液，可能情况为接头Fittings中间的管子未和接口处贴紧。

不同厂家的管线及色谱柱头结构有差异，最好不要混用，必要时可使用PEEK管及活动接头；

3、操作过程若发现压力非常高，则可能管路已堵，应先卸下色谱柱，然后用分段排除法检查，确定何处堵塞后解决。

若是保护柱或色谱柱堵塞，可用小流量流动相或以小流量异丙醇冲洗，还可采用小流量反冲的办法（新柱不提倡），若还是无法通畅，则需换柱；

4、运行过程中自动停泵，可能为压力超过上限或流动相用完；

5、样品瓶中样品较少，自动进样器进样针无法到达液面，可采用调低进样针进样高度的办法，注意设置时不要使进样针碰到瓶底，微量样品分析应使用微量样品瓶；

6、自动进样器进样针未与样品瓶瓶口对准时，需重新定位。

7、泵压不稳或流量不准，可能为柱塞杆密封圈问题或sealwash垫圈问题，需更换；

8、基线产生不规则噪声，可能原因为系统不稳定或没达到化学平衡（使其平衡，若用离子对试剂，在首次使用使需要足够的时间和溶剂体积，色谱柱才能达到足够的平衡），流动相被污染（更换流动相，清洗储液器、过滤器，冲洗并重新平衡系统），色谱柱被污染（为证明可能的原因更换系统的色谱柱或使用一根同类的被证明性能好的色谱柱），检测器不稳定；

9、短期有规则的噪声，可能原因为泵压不稳或泵脉冲，调节溶剂不适当（如两种溶剂的互溶性问题），泵入口管路松或堵塞，泵太脏，泵柱塞磨损，检测器不稳定；

10、  长期有规则噪声，可能原因为室温不稳（未使用柱温箱）或使用柱温箱不当；

11、  基线漂移，可能原因为系统不稳或没有达到化学平衡，室温不稳（未使用柱温箱），流动相污染或分解，柱污染，检测池泄漏，系统泄漏，固定相流失（另选流动相，另选色谱柱），测定的波长选择错误（对溶剂有吸收），样品组分保留太长（用强度合适的溶剂清洗色谱柱），检测器不稳定；

12、  每次进样时的保留时间不重复，可能原因为系统不稳或未达到化学平衡，由于气泡、各部件磨损等原因引起的泵压或泵脉冲输液不稳定，进样体积太大或样品浓度太高平衡被破坏，溶剂配比不合适，柱被污染；

13、  无峰，可能原因为检测器选择错误，使用错误的流动相，样品降解；

14、  色谱峰比预计的小，可能原因为进样体积错误，检测器灯故障，进样问题（瓶号错、进样体积不合适、进样错误、针头堵塞）；

15、  峰变宽，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高，过滤器、保护柱入口、柱入口或连接管路有部分堵塞，检测器时间常数设置错误，进样器问题（如阀漏、针头堵塞或损坏），柱或保护柱被污染，对流动相来说样品溶剂太强，使用错误的色谱柱，温度变化；

16、  出现双峰/肩峰，可能原因为保护柱或柱入口部分阻塞，柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏；

17、  前沿峰，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏，对于流动相来说样品溶剂非极性太强（对于反相柱），柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效；

18、  脱尾峰，可能原因为柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样器问题（如阀漏等），检测器时间常数设置错误；

19、  出现鬼峰，可能原因为流动相被污染，样品预处理时产生降解或混入杂质，先前进样的流出物，样品定量管清洗不当，注射器脏，柱被污染，进样装置被污染，流动相中含有稳定剂/稳定剂变化。

水膜和油膜的外壳有标示的。

油膜外有写F型

Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤

（一）、开机：

   1、打开计算机,进入WindowsNT（或Windows2000）画面,并运行BootpServer程序。

    2、打开1100LC各模块电源。

    3、待各模块自检完成后，双击Instrument1Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。

   4、从“View”菜单中选择“MethodandRuncontrol”画面,单击”View”菜单中的“ShowTopToolbar”，“Showstatustoolbar”，“Systemdiagram”,”Samplingdiagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。

  5、把流动相放入溶剂瓶中。

  6、打开Purge阀。

  7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入泵编辑画面。

  8、设Flow：

5ml/min，单击OK。

  9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pumpcontrol选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。

  10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击PumpControl选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭Purge valve。

  11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：

1.0ml/min。

  12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。

也可输入停泵的体积。

单击Ok。

（二）数据采集方法编辑：

   1、开始编辑完整方法：

    ●从“Method”菜单中选择“Editentiremethod”项，如上图所示选中除“Data analysis”外的三项，单击Ok，进入下一画面。

   2、方法信息：

    ●在“MethodComments”中加入方法的信息（如：

方法的用途等）。

    ●单击Ok进入下一画面。

   3、泵参数设定：

（以二元泵为例）

     ●在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“SolventB”处输入70.0,（A=100-B）,也可Insert一行”Timetable”,编辑梯度。

在“PressureLimitsMax”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

    ● 单击Ok进入下一画面。

   4、自动进样器参数设定:

     ●选择合适的进样方式,进样体积1.0ul,洗瓶位置为6号。

“StandardInjection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。

“InjectionwithNeedleWash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。

“Useinjectorprogram”---可以点击Edit键进行进样程序编辑。

    ●点击Ok进入下一画面。

   5、柱温箱参数设定:

     ●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>”键,如图所示,选中”Sameasleft”---使柱温箱的温度左右一致。

      ●点击ok进入下一画面。

    6、VWD检测器参数设定:

      ●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peakwidth（Responsetime）”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间,如>0.1min （2s）。

       ●在Timetable中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm。

点击ok进入下一画面。

   7、DAD检测器参数设定:

      ●检测波长:

254nm,BW=30nm,    参比波长=350nm,BW=100nm; 

      ●检测波长：

一般选择最大吸收处的波长。

样品带宽BW：

一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。

参比波长：

一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。

参比带宽BW：

至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。

Peakwidth（Responsetime）：

其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。

Slit—狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。

同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。

选中所用的灯。

      ●点击Ok进入下一画面。

     8、RID检测器参数设定:

      ●色谱条件:

        进样体积:

20ul。

     光学单元温度:

 Off。

        极性:

正。

          峰宽（响应时间）:

 4s 。

       ●“OpticalUnitTemperature”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。

“Peakwidth”---大多数分析设为4S，只有在高速分析下设为更短。

“Automaticrecyclingafteranalysis”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。

      ●点击RID图标，选择RID Control：

Heater设为On，若要循环流动相，必须将“RecyclingValve”设为ON。

手动purge参比池，将其设为On，并输入Purge时间。

     9、FLD检测器参数设定:

       色谱条件：

       ●  样品：

P/N01018-68704 用甲醇稀释为1:

10。

       ●   进样体积：

5ul。

       ●   柱温箱:

 30℃。

  EX=246nm,EM=317nm,PMT=10。