集约化养鸡过程中新城疫免疫存在问题的探讨.docx

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集约化养鸡过程中新城疫免疫存在问题的探讨

集约化养鸡过程中新城疫免疫存在问题的探讨

　　【摘要】鸡新城疫（鸡瘟）是鸡的一种烈性传染病，是由鸡新城疫病毒引起的一种急性高度传染性疾病。

免疫预防是重要的防治手段，但影响免疫效果的因素有很多，诸如疫苗的质量、其他疫病的影响、强毒感染和变异株出现、免疫时间和免疫程序不当、鸡场环境卫生较差等。

尤其是疫苗的保存温度对疫苗的效价影响最大。

为此，我们对鸡新城疫疫苗设置不同温度刺激半小时稀释后免疫，以期找出解决影响免疫效果因素的方法和为疫苗合适的保存温度提供佐证材料。

　　【关键词】鸡新城疫；抗体；血凝；血凝抑制

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　1.1.1鸡新城疫（ND）冻干苗

　　来源于遵义市动物疫病控制中心。

　　1.1.2试验鸡群

　　来源于遵义市红花岗区深溪、南关两个镇蛋鸡、肉鸡6户养殖大户，共计6000羽。

　　1.1.3主要试剂

　　柠檬酸三钠、重铬酸钾、硫酸、0.9%生理盐水、PBS液。

　　1.1.4主要仪器与设备

　　96孔V型微量血凝板、单道和八道微量精密移液器、加样槽、吸嘴、微型振荡器、离心机、恒温箱。

　　1.2试验时间与地点

　　2009年12月，在深溪、南关两镇选定了蛋鸡、肉鸡养殖各3户进行鸡群免疫。

实验室工作于2011年8～12月在红花岗区农牧局动物疾病控制中心实验室进行。

　　1.3影响疫苗免疫效果因素分析

　　1.3.1是疫苗检查不严影响免疫效果

（1）瓶盖检查。

检查瓶盖是否松动、脱落。

瓶盖松动、脱落的疫苗因其密闭保存条件改变会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低进而导致疫苗的效价降低、失效甚至产生副作用。

（2）标签检查。

检查标签上的生产批文批号、生产日期、疫苗性状、保存条件、保存时间、使用剂量。

没有取得生产批文批号的疫苗质量不可靠；生产日期和保存时间的检查主要看疫苗是否超过保存期，超过保存期的疫苗效抗原性（免疫原性）降低或消失，进而导致疫苗的效价降低、效价差，甚至失效；保存条件是否与标签上规定的条件一致，不符合标签规定保存条件保存的疫苗，疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

　　1.3.2疫苗保存不当影响免疫效果

（1）保存温度不当。

保存温度过高要或过低均会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

（2）保存避光不当。

疫苗保存需要避光保存，如果避光条件不好也会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

　　1.3.3疫苗使用操作不当影响免疫效果

（1）疫苗稀释不当。

疫苗稀释不当有几种情况：

不用规定的稀释液稀释疫苗；不按规定的稀释剂量稀释疫苗；稀释液与疫苗温差太大，会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失。

（2）疫苗使用不当。

疫苗使用不当有几种情况：

不按规定的使用方法使用；不按规定的使用剂量使用；使用器械、注射部位消毒不严。

　　（3）使用过程中保管不当。

疫苗在稀释后使用过程中因保管不当，使稀释后的疫苗长时间置于强光或高温环境下会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

　　1.4试验方法

　　1.4.1试验分组

　　将鸡新城疫（ND）疫苗从低温冰箱拿出后，分别在15～60℃（以5℃为梯度）恒温条件下保存30min后稀释进行免疫，从低温冰箱拿出后立即稀释免疫，并设空白对照组。

试验总共12组。

　　1.4.21%红细胞悬液制备[5，6]

　　由健康鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：

全血=1：

2的比例），迅速混匀。

在离心机中以3000转/min离心5min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/min离心5min，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。

放入4℃冰箱中可保存2～3天。

使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。

现用现配。

　　1.4.3血清制备

　　每只鸡翅静脉采血0.5～1ml，静置待血清析出后或离心备用。

　　1.4.4血凝（HA）试验[7，8～15]

　　①先用微量移液器向96孔V型反应板的每孔加生理盐水25μl；

　　②用微量移液器吸取待测抗原25μl于第一孔中并抽吸6次混合，后吸出25μl至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25μl；

　　③微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μl；

　　④置于微量振荡器上振荡1min后室温（18～22℃）静置30min观察结果；

　　⑤将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒凝集。

能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。

即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。

　　⑥4单位抗原校正，按逐级稀释的方法将抗原作相应稀释后的HA试验，当从第五孔开始为完全沉淀，所以表明所配4单位抗原准确。

　　1.4.5血凝抑制（HI）试验

　　每排孔检查1份血清。

步骤如下：

　　①微量移液器先加25μl生理盐水于各孔中；

　　②用微量移液器吸取待检血清25μl置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25μl，最后一孔不稀释，为红细胞对照；　　③用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25μl；

　　④置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀；

　　⑤室温静置20min；

　　⑥用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25μl；

　　⑦置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置40min后观察结果；

　　⑧结果判定：

以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。

　　2结果与分析

　　2.1血凝（HA）试验结果

　　HA试验结果，检测用抗原在微量反应板倍比稀释第8孔完全凝集1%红细胞，其抗原效价为1：

256。

并对4单位抗原作了校正，4单位抗原校正成立。

　　2.2血凝抑制（HI）试验结果与分析

　　空白对照组：

空白对照组免疫抗体效价为log4。

常规对照组：

常规对照组免疫抗体效价为log64。

试验组：

试验组各温度段疫苗免疫抗体效价分别是15℃为log64；20℃为log32；25℃为log16；30℃为log8；35℃为log8；40℃为log8；45℃为log4；50℃为log4；55℃为log4；60℃为log4。

　　由上可知，温度上升1个梯度（5℃）刺激疫苗30min，疫苗免疫抗体滴度降低1个滴度，当温度上升到40℃及40℃以上刺激疫苗30min，疫苗失去有效抗原性。

当处置温度≤25℃时疫苗免疫均有效。

　　2.3过期疫苗、保质期内瓶塞松动疫苗、性状颜色与标签不符疫苗免疫效价检测分析

　　过期疫苗免疫抗体效价为log2；保质期内（过一半保存期）瓶塞松动疫苗免疫抗体效价为log2；性状颜色与标签不符疫苗免疫效价为log0。

　　3结论与讨论

　　3.1影响疫苗效价的因素

　　3.1.1疫苗质量

　　除正规合法的厂家生产的疫苗质量能保证外，新城疫冻干苗潮湿、瓶盖松动均能影响疫苗的质量，进而影响疫苗的效价。

　　3.1.2保存温度

　　疫苗从出厂到代理商，再到养殖户的过程中可能要经过多次的融冻，虽然标签在有效期之内，但效价已经明显降低，甚至失效。

我们研究结果显示，疫苗从低温保存设备拿出后立即稀释进行免疫的常规操作，与在25℃温度刺激疫苗30min后稀释免疫均能达到有效免疫效果，但高于25℃温度对疫苗进行刺激后免疫达不到有效免疫的效果。

　　3.1.3外界环境

　　天气突变、通风不良、舍内氨气过浓等应激因素都会影响免疫效果。

而饲料营养不均衡也影响免疫效果。

　　3.1.4其他因素

　　此外，疫苗正确的稀释和免疫方式是免疫质量保证的关键。

而鸡体内的母源抗体、疫苗之间相互干扰、消毒药与抗病毒药、机体抵抗力、合理免疫程序均影响疫苗效价。

　　3.2免疫过程中影响免疫效果的因素

　　3.2.1疫苗检查不严影响免疫效果

（1）瓶盖检查。

检查瓶盖是否松动、脱落。

瓶盖松动、脱落的疫苗因其密闭保存条件改变会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低进而导致疫苗的效价降低、失效甚至产生副作用。

（2）标签检查。

检查标签上的生产批文批号、生产日期、疫苗性状、保存条件、保存时间、使用剂量。

没有取得生产批文批号的疫苗质量不可靠；生产日期和保存时间的检查主要看疫苗是否超过保存期，超过保存期的疫苗效抗原性（免疫原性）降低或消失进而导致疫苗的效价降低价差甚至失效；保存条件是否与标签上规定的条件一致，不符合标签规定保存条件保存的疫苗，疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失进而导致疫苗的效价降低甚至失效；疫苗性状是否与标签上描述的性状一致，与标签上描述的性状不一致的疫苗已变性（变质），可能导致效价降低、失效甚至产生副作用。

　　3.2.2疫苗保存不当影响免疫效果

（1）保存温度不当。

保存温度过高要或过低均会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

（2）保存避光不当。

疫苗保存需要避光保存，如果避光条件不好也会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

　　3.2.3疫苗使用操作不当影响免疫效果

（1）疫苗稀释不当。

疫苗稀释不当有几种情况：

不用规定的稀释液稀释疫苗；不按规定的稀释剂量稀释疫苗；稀释液与疫苗温差太大，会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失。

（2）疫苗使用不当。

疫苗使用不当有几种情况：

不按规定的使用方法使用；不按规定的使用剂量使用；使用器械、注射部位消毒不严。

都会使疫苗的抗原性（免疫原性）在家禽免疫应答过程中不能充分发挥进而影响免疫抗体的形成导致免疫效果受影响。

　　（3）使用过程中保管不当。

疫苗在稀释后使用过程中因保管不当，使稀释后的疫苗长时间置于强光或高温环境下会使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

　　3.3保证疫苗效价的综合措施

　　一是从正规厂家进购疫苗，并在使用时仔细检查瓶盖是否松动、脱落，按照说明书要求进行稀释和免疫。

　　二是正确的疫苗保存、运输方式，根据疫苗类型选择相应的保存方式，在运输过程中根据疫苗类型（需常温或低温保存）和运输距离选择合理的运输保温方式，立即使用的需低温保存的疫苗在短距离运输时可选择冰盒等简便的保温设备。

尽量减少运输次数和反复冻融次数。

　　三是选择合理的免疫时间。

尽量选择在早晨或傍晚气温较低时候进行免疫，温度过高不仅影响疫苗质量，而且应激反应大。

根据鸡群年龄及健康状况适时进行免疫。

　　四是实验室时保持合适的温度。

温度的高低影响到抗原、抗体及红细胞的活性的高低，温度过高时会破坏红细胞表面的凝集素，温度过低时出现不凝集或不抑制现象而使监测结果不准确，所以在实验前必须将所有需要用的物品达到室温下才能进行检测，最适宜温度为18～25℃。

　　五是掌握正确的判定标准。

每做一批试验设1孔为标准阳性血清对照孔作为参照（也可作为抗原含量的间接效价），以红细胞与病毒的凝集完全被抑制的孔来确定HI抗体滴度。

即竖放微量板让沉积的红细胞能自然流动的最后孔为HI价。

　　3.4解决免疫过程中影响免疫效果因素的方法

　　3.4.1针对疫苗检查不严采取的措施

（1）认真检查瓶盖。

发现瓶盖松动、脱落的疫苗不能使用。

（2）认真检查标签。

没有取得生产批文批号的；生产日期和保存时间超过保存期；保存条件是否与标签上规定的条件一致的；疫苗性状是与标签（或说明书）上描述的性状不一致的疫苗不能使用。

　　3.4.2针对疫苗保存采取的措施

　　对于疫苗的保存通常要求避光低温保存。

但不同的疫苗有具体的不同要求，对任何一种疫苗都应仔细阅读其标签和说明书，严格按标签和说明书上要求的保存条件进行保存疫苗，不能随意改变疫苗标签和说明书上要求的保存条件，以确保疫苗有效地进行保存。

杜绝因保存不当导致疫苗效价降低甚至失效。

　　3.4.3针对疫苗使用操作不当采取的措施

（1）疫苗的稀释。

疫苗的稀释严格按要求，使用规定的稀释液、按规定的稀释剂量进行稀释，在稀释疫苗时要注意使稀释液的温度与待稀释的疫苗温度接近。

（2）疫苗使用。

疫苗在使用时要认真阅读疫苗标签和说明书，严格按标签和说明书上的要求做到按要求的使用剂量、使用方法、使用部位进行免疫，同时使用的器械、注射部位按要求严格消毒。

　　（3）疫苗使用过程中的保管。

疫苗稀释后在使用的过程中要严格做到避光、低温保存，稀释后的疫苗不能置于强光照射和高温环境下。