微囊藻毒素提取和提纯研究.docx

微囊藻毒素提取和提纯研究.docx

《微囊藻毒素提取和提纯研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微囊藻毒素提取和提纯研究.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

微囊藻毒素提取和提纯研究

微囊藻毒素的提取和提纯研究

第24卷第2期

2004年3月

环境科学ACTASCIENTIAECIRCUMSTANTlAEVo1.24.No.2

Mar.,20O4

文章编号:

0253—2468（2004）02—0355—05中图分类号:

Q93—33文献标识码:

A

微囊藻毒素的提取和提纯研究

闫海,潘纲,张明明,陈海柳,邹华（中国科学院生态环境研究中心,环境水质学国

家重点实验室,北京100085）

摘要:

对采自云南滇池水华蓝藻细胞中的微囊藻毒素（Microcystlns,MCs）的提取与提纯方法进行了研究.结果表明,在藻细

胞干重浓度为20g?

L下,与不同甲醇浓度提取液相比,40%甲醇溶液可以最有效地从藻细胞中提取出MC—RR和MC—LR.将

MCs提取液过Waters固相萃取小柱后,用70%甲醇溶液洗脱吸附于柱上的MCs,可以分别获得7.3%和3.5%纯度的MC—RR

和MC—LR.通过观察洗脱液的颜色变化,收集蓝绿色和橘黄色后面流出的基本无色的洗脱液,可以获得纯度为28.6%和

129%的MC—RR和MC—LR.

关键词:

微囊藻毒素;提取;提纯

Studyontheextractionandpurificationofmicrocystins

YANHai,PANGang,ZHANGMingming,CHENHailiu,ZOUHua（StateKeyLaboratoryofEnvironmentalAquatic

Chemistry,ResearchCenterforEco-environmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Bering100085）

Abstract:

Themethodsforextractingandpurifyingmicrocystin（MCs）indrycyanobactefialceUstakenfromDianchiLdke,YunnanProvince,

werestudiedinthispaper.40%methanol—watersolutionWasfoundtobeanoptimumsolutionforeffectivelyextractingMC—RRandMC-LR

fromcyanobaetefialcellsamongdifferentratiosofmethanolwhentheconcentrationofdrycyanobacterialceUswas20g'L_..Aftertheextrac—

tionsolutionof40%methanolcontainingMCswaspassedthroughacartridge（Waters,OASIST"HLBCartridge）,MCswerepurifiedbythe

elutionwith70%methano1.and7.3%and3.5%puritiesofMC—RRandMC-LRwereobtained.Bycollectingtheachromaticfractionofthe

elutionafterblue-greenandorange-yellowcolorelution,MC—RRandMC—LRwiththepuritiesof28.6%and12.9%wereobtained.

Keywords:

microcystins;extraction;purification

世界上淡水湖泊藻类水华发生的频率与严重程度都呈现增长的趋势,其中蓝藻是引起藻

类水华污染的主要藻类"J.欧洲,非洲,北美洲和南美洲分别有53%,28%,48%和41%的湖

泊存在不同程度的富营养化现象,亚太地区54%的湖泊处于富营养化状态.我国云南滇池,江

苏太湖和安徽巢湖等多个淡水湖泊都相继发生了不同程度的蓝藻水华污染现象并检测到了藻

毒素的存在.在已发现的各种不同藻毒素种类中,微囊藻毒素（Microcystins,MCs）是一种

在蓝藻水华污染中出现频率最高,产生量最大和造成危害最严重的藻毒素.调查发现,饮用水

中MCs的存在与人群中原发性肝癌和大肠癌的发病率有明显的相关性'.根据MCs对猪毒

性的实验结果,世界卫生组织（WHO）推荐饮用水中的MCs浓度不高于1.0ttg?

L".

Bote等首先进行了MCs的提取提纯研究,确定出了多种不同的MCs提取提纯方法.目

前,普遍采用的提取MCs溶剂主要是不同比例甲醇一水溶液,其中50%到80%的甲醇溶液被认

为是MCs的最有效提取液引.应用C18等不同类型的分离柱在HPLC上根据MCs紫外吸收出

峰收取对应的流动相,是目前MCs提纯方面最普遍应用的方法.此种方法虽然可以获得较

收稿El期:

2003—04—11;修订18期:

2003—08—29

基金项目:

国家自然科学基金（编号:

30270277,20377047和20177029）;973项目（2002CB412308）;863项目（2002AA601120）

作者简介:

闫海（1962一）,男,副研究员（博士）haiyan@mail,;通讯联系人:

gpan@mail,reees,

356环境科学24卷

高纯度的MCs,但分离柱价格昂贵,每次提纯的MCs量也很少,因此通过不同提取与提纯方法

的研究获得大量高纯度的MCs用于生物降解,光解和吸附的实验研究具有重要的意义.

1实验材料与研究方法

1.1蓝藻样品

用于提取提纯MCs的藻类样品取自云南滇池的水华蓝藻,取样时间是2001—07上旬.采集

的水华蓝藻经晾晒干燥后,粉碎并过100目筛.将藻粉放入冰箱中一l8℃冷冻保存备用.

1.2MCs标准样品及固相萃取柱

在标准溶液配制中所用MC—RR（分子式:

C4H,N.O分子量:

1038.2）和MC—LR（分子

式:

c鹕HN..0.:

分子量:

995.2）是美国Sigma公司生产的标准品,纯度都在95%以上.采用

Waters公司生产的固相萃取柱（Waters,OASISHLBCartridge）对提取的MCs进行提纯.

1.3提取MCs方法

取0.2g采自云南滇池的水华蓝藻粉,分别加入10mL不同浓度的甲醇溶液,藻粉的浓度

为20g?

L～.经1h的超声波振荡后,提取液经高速离心（12000r?

min～,10min）和0.45m无

机滤膜过滤后进行HPLC测定.

1.4MCs测定方法

采用高压液相色谱（岛津LC一10A）测定MCs.测定的条件是:

流动相:

40%乙腈,60%水,在

水相中含有0.05%的三氟乙酸.流速:

1.0mL?

min～.紫外检测波长:

239nm,进样量20.所用

的分离柱是WatersBondapakCl8column（300mm×3.9mm）柱.

2结果与讨论

2.1MC—RR和MC—LR的提取

图1显示,在纯水作为提取液时,MC—RR和MC—LR的浓度分别为l8.3和9.2唱?

L～.随着提

取液中所含甲醇比例的增加,提取液中的MC—RR和MC—LR浓度也有所提高.当甲醇比例提高到

40%时,提取液中的MC—RR和MC—LR浓度均达到最大,分别为25.1和l6.7唱?

L～.在甲醇比例

提高到40%以上时,提取液中的MCs浓度随甲醇浓度的升高而下降.此结果说明与不同甲醇

餐

星

图1不同甲醇浓度提取液中的MC.RIR和MC—LR浓度

Fig.1ConcentrationsofMC-RRandMC-LRinextracting

solutionscontainingdifferentratiosofmethanol

浓度相比,40%甲醇溶液可以最大限度地

从藻细胞中提取出MC—RR和MC—LR.采用

40%甲醇作为提取液,在藻细胞干重浓度

为20g?

L～,提取液中的MC—RR和MC—LR

浓度分别为25.1和l6.7mg?

L～,这样经

计算得到藻细胞中MC—RR和MC—LR含量

至少分别为1.26和0.84mg?

g～.因为国

内外至今尚未研究确定适合不同藻类提

取MCs的最有效提取液,因此很难通过提

取的方法确定藻细胞中MCs的准确含量,

虽然我们发现40%甲醇可以有效地提取

出MCs,但是此提取液能否将藻细胞中的

MCs全部提取出来还有待于进一步研究.

2期闫海等:

微囊藻毒素的提取和提纯研究357

2.2MC.RR和MC.RR的提纯

取3mLMC.RR和MC.LR浓度分别

为112.3和66.5mg?

L的40%甲醇提取

液,过Waters固相萃取柱后,先后用1mL首

甲醇溶液从低到高浓度进行梯度洗脱.结

果表明（图2）,无论是MC.RR还是MC.里

LR都主要集中在50%到70%甲醇洗脱

液中,其中60%甲醇洗脱液中的MC.RR

含量最大,60%～70%甲醇洗脱液中的

MC.LR浓度最高.因此先用40%甲醇溶

液提取藻细胞中的MCs,提取液过Waters

固相萃取柱后,再用70%甲醇洗脱,是初

步提纯MC.RR和MC.LR的一条有效方法.用此方法得到的洗脱液,经用氮气吹干后得到的不

挥发物中,MC.RR和MC.LR的纯度分别为7.3%和3.5%.

通过大量的实验与观察发现,在用70%甲醇溶液洗脱吸附于固相萃取柱上MCs的过程

中,洗脱液的颜色基本上按照首先是蓝绿色,然后是橘黄色,最后是基本透明无色的规律进行

变化.按顺序收集这3种不同颜色的洗脱液,分别在HPLC上分析后得到的HPLC谱图显示

（图3）,首先洗脱下来的蓝绿色洗脱液中,基本没有MC.RR和MC.LR存在.接下来收集的橘黄

色洗脱液中既有杂质峰又有MC.RR和MC.LR峰的出现,其中杂质峰的峰高和面积都比较大.

但在最后收集的透明无色洗脱液中,无论是MC.RR和MC.LR的峰高和峰面积都远远大于杂

餐

>

图370%甲醇洗脱液中MC.RR和MC-LR的

HPLC图谱

Fig.3HPLCchromatogramofMC—RRandMC-LRin70%

methanololutingsolution

质峰的峰高和峰面积.根据洗脱液颜色变化,收

集蓝绿色和橘黄色流过后的无色透明洗脱液,经

用氮气吹干后,可以获得28.6%和12.9%纯度

的MC.RR和MC.LR.

为了进一步证明提纯的就是MC.RR和MC.

LR,将MCs标准品和提纯的MCs分别在HPLC

上进行注射,从保留时间和在200到300nm紫外

区域的扫描吸收图谱两方面进行验证.图4显示

了15mg?

L标准品MC.RR和MC.LR的HPLC

出峰图谱,MC.RR和MC.LR的保留时间分别为

4.75和7.30min,与提纯MC.RR和MC.LR的保

留时间4.76和7.37min基本一致（图3）.另外,

图5显示了提纯的MC.RR和MC.LR在200到

300nITI紫外吸收扫描图谱,无论是MC.RR还是

MC.LR均在238到242nm范围有最强的吸收

峰,这也与标准品MC.RR和MC.LR的扫描吸收

峰形和最大吸收峰的波长范围完全一致（图6）,

因此我们确认从滇池水华蓝藻中提取并提纯的

化合物就是MC.RR和MC.LR.

环境科学24卷

t/min

图4标准品MC.RR和MC.LR在200到

300Dill范围的紫外吸收图谱

Fig.4TheAbsorbanceofstandardMC—RRandMC—LRat

15mg?

L一'detectedintheultravioletrangefrom

200to300Bin

图6标准品MC.RR和MC.LR的HPLC图谱

Fig.6HPLCchromatogramofstandardMC—RRand

MC—LRat15mg.L一'

图5提取提纯后的MC.RR和MC.LR在200

到300Dill范围的紫外吸收图谱

Fig.5UVspectrumofpurifiedMC—RRandMC—LRin

rangefrom200to300nm

2.3MC.RR和MC—LR的提取提纯

在从蓝藻细胞中提取MCs研究方面,

虽然国外有大量的研究报道,发现MC—RR

和MC—LR的最大紫外吸收峰在238到242

nm

_】'j

与本研究发现的最大紫外吸收峰

范围完全一致（图5,图6）.目前,不同浓度

的甲醇溶液是最普遍应用的MCs提取液,

其中50%～80%的甲醇溶液被认为是MCs

的最有效提取液n,但Nina和Hansl】报道

的研究结果显示,分别采用水,5%乙酸,

70%甲醇和100%甲醇作为提取液,从铜绿

微囊藻细胞中提取MC.RR的效率基本一

样.这说明针对不同藻种,其MCs最佳提取液中的甲醇比例可能变化很大.本研究发现,40%

甲醇溶液可以最有效地从滇池水华蓝藻细胞中提取MC—RR和MC.LR（图1）,略低于推荐的

5O%～8O%甲醇提取液浓度范围.

据研究报道,25%～70%暴发的湖泊水华蓝藻可产生藻毒素¨.本研究结果证明,滇池水

华蓝藻不仅可以产生MC—RR和MC.LR,而且这2种MCs的产毒量也达到了很高水平（图1）.

就MCs的类型而言,世界上不同地区的水华蓝藻产生的MCs类型也不相同.一般在欧洲温度

较低的地方,MC—LR是主要类型,但在亚洲温度较高的地区,MC.RR是产生的主要类型.Rapa—

la等n训发现,固氮水华鱼腥藻在水温25℃以下时主要产生MC—LR,但在高于25℃时产生的主

要是MC—RR.由于云南滇池地处亚热带地区,采样时间又在7月份的高温季节,因此采集的蓝

藻样品中MC—RR的含量明显高于MC—LR的含量（图1）.

用40%甲醇溶液从藻细胞中提取MCs后,提取液中包含了多种藻细胞色素.过固相萃取

柱后,色素和MCs同时都吸附在柱上.在用70%甲醇溶液洗脱过程中,因为MC—RR和MC—LR

2期闰海等:

微囊藻毒素的提取和提纯研究359

比细胞色素保留时间长,因此色素被首先洗脱出来.因此通过观察洗脱液的颜色变化,可以收

集到较高纯度MCs的洗脱液,使MC—RR和MC—LR得到更进一步提纯（图3～图6）.虽然采用

HPLC法提纯MCs可以获得纯度很高的MCs14],但是在HPLC上每次注射样品量有限,故很难

得到大量提纯的MCs供使用.我们采用固相萃取柱吸附MCs后,通过观察洗脱液的颜色变化

来收集提纯MCs,虽然获得的MCs纯度只有40%左右,但可以获得比较大量的MCs,满足MC

的各种环境化学行为实验的需要.同时采用此方法提取提纯MCs,具有成本低,操作直观简便

等优点.

4结论

（1）采用40%甲醇溶液可以最有效地从滇池水华蓝藻细胞中提取出MC—RR和MC—LR.藻

细胞中MC—RR和MC—LR含量至少分别为1.26和0.84mg?

g～,其中MC—RR含量明显高于MC—

LR的含量.

（2）经40%甲醇溶液提取藻细胞中的MCs,过Waters固相萃取柱,用70%甲醇溶液

洗脱,可以获得纯度分别为7.3%和3.5%的MC—RR和MC—LR.（3）在用70%甲醇溶液洗脱过

程中,通过观察洗脱液颜色变化,收集蓝绿色和橘黄色后面流出的基本无色的洗脱液,可以获

得更高纯度分别为28.6%和12.9%的MC—RR和MC—LR.

参考文献:

[2]

[3]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

BrittainS,MohamedZA,WangJ,et.IsolationandcharacterizationofmicrocystinsfromaRiverNilestrainofOsciUatoriatenuis

AgardhexGomont[J].Toxicon,2000,38:

1759—1771

GromovBV,Vepri~kyAA.MamkaevaKA.et.ASurveyoftoxicityofcyanobactefialbloomsinLakeLadogaandadjacentwa—

terbodies[J].Hydrobiologia,1996,322:

149—151

FalconerIR.ToxiccyanobacterialbloomproblemsinAustralianwaters:

Risksandimpactsonhumanhealth[J].Phycologia.2001.

4O（3）:

228—233

HaradaK.Recentadvancesoftoxiccyanobacteriaresearch【J].JofHeal山Science,1999,45（3）:

150_一165

顾岗.太湖蓝藻暴发原因及其控制措施[J].上海环境科学,1996,15（12）:

1o_-11

张维昊,徐晓清,丘昌强.水环境中微囊藻毒素研究进展[J].环境科学研究,2001,14

（2）:

57—61

闫海,潘纲,张明明.微囊藻毒素的研究进展[J].生态,2002,22（11）:

1968—1975

林毅雄,刘秀芬,闫海.滇池铜绿微囊藻毒素及其在水体中的分布[J].环境污染治理技术与设备,2001,2（5）:

1o_-13

俞顺章,赵宁,资晓林.饮用水微囊藻毒素与我国原发性肝癌关系的研究[J].中华肿瘤杂志,2001,23

（2）:

96—99

周伦,鱼达,余海.饮用水源中的微囊藻毒素与大肠癌发病的关系[J].中华预防医学杂志,2000,34（4）:

224--226

FalconerIR.Anoverviewofproblemscausedbytoxicblue—greenalgae（cyanobacteria）indrinkingandrecreationalwater[J].En—

vironmentalToxicol,1999,14

（1）:

5—12

BotesDP,KrugerH,ViljoenCC.Isolationandcharacterizationof4toxinsfromblue—green—alga,Microcystis—aeruginosa[J].Toxi—

con,1982,20（6）:

945—954

LawtonLA,EdwardsC.Purificationofmicrocystins[J].JofChromatography,2001,912:

191—209

SpoofL,MeriluotoJ.RapidseparationofmicrocystinsandnodularinusingamonolithicsilicaC18column[J].JofChromayography

A,2002.947:

237—254

PyoD,ShinH.ExtractionandanalysisofmicrocystinsRRandLRincyanobacteriausingacyanocartridge[J].JofBiochemand

BiophysMethods,2002.51:

1o3—109

RamananS,TangJ.VelayudhanA.Isolationandpreparativepurificationofmicrocystinvariants[J].JofChromatography,2000,

883:

103一ll2

NinaG,HansU.eextractionandstabilityofmicrocystin—RRindifferentsolvents[J].Phycologia,1996,35（6,supp1）:

8o_-82

DuyTN,LamPKS,ShawGR.Toxicologyandriskassessmentoffreshwatercyanobacterial（Blue—greenAlgae）toxinsinwater

[J].RevEn~ronContamToxicol,2000,163:

113—186

RapalaJ,SivonenK.AssessmentofenvironmentalconditionsthatfavorhepatotoxicandneurotoxicAnabaenaspp.strainscultured

underlightlimitationatdifferenttemperatures[J].MicrobialEcology,199836

（2）,181—192

ji]]456789加¨