生物学酵母蔗糖酶的提取工艺.docx
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生物学酵母蔗糖酶的提取工艺
酵母蔗糖酶的提取工艺
摘要
蔗糖酶是一种水解酶,广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。
它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。
采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：
50%（w/w）乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。
纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。
蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。
关键词：
酵母；蔗糖酶；提取；纯化
StudyonPurificationofInvertasefromYeast
Abstract
Sucraseiswidespreadinprokaryotesandeukaryotes.Sucrasecatalyzestheirreversiblehydrolysisofsucroseintoglucoseandfructose.themainfromsofcarbonandenergysuppliesinmicroorganismgrowthanddevelopment.
Thispaperusedthreemethodstoextractinvertasefromyeast,whichincludedinthismanuscript,threedifferentextractionmethodbreakingcellsbyaddingmethylbenzene,frostgrinding,andaddingSDSforextractinginvertasefromyeastwereinvestigated.Thenthepurifiedinvertasewasobtainedbyprecipitatationwith50%ethylalcohol、sequentialammoniumsulpateprecipitationandDEAE-Sepharoselon-exchangechromatography.ThepurifiedsucrasewascharacterizedbySDS-PAGE.Theresultsshowedallthreemethodshadbothadvantagesanddisadvantages.TheinvertaseextractedbyaddingSDSandfrostgrindinghadmuchmoretotalactivitythanthatofextractedbyaddingmethylbenzene.Ahighesttotalinvertaseactivitywasfoundintheforstgrinding,anditwasaconventandeconomicalmethodforcommercialproductionofinvertasefromyeast.
Theresultsofourstudywerefollowed:
1、Purificationofinvertasefromyeast
Thespecificactivitywas947.805U/mg,purificationfoldwas32.28.Theactivityrecoveryofsucrasewas51.6%.
2、Propertiesofsucrase
Thekineticcharactersoftheenzymehavebeenstudied.TheoptimumPHandoptimumtemperaturefortheenzymearePH4.5and50℃.Kmis21mmol/LandVmaxis6.57ug/min.
Keywords:
yeast;invertase;extraction;purification
第一部分文献综述
蔗糖酶（Sucrase,EC3.2.1.26）又称转化酶（Invertase），是将蔗糖水解成D-葡萄糖和D-果糖的ß-D-果糖苷酶的一种。
除广泛分布于微生物、植物外，类似的活性也在动物的消化液中发现。
传统的酵母蔗糖酶的提取方法是甲苯自溶法，尽管此方法所用试剂简单、价格低廉，但由于其消耗时间长、重复性差、酶活性较低等缺陷，现已很少采用。
目前也有采用乙醇沉淀法和硫酸铵分级沉淀法制得的蔗糖酶，再用柱层析的方法提纯，由于柱层析工艺复杂，处于实验室探索研究阶段。
经查新，已见采用冻融法和SDS抽提法的文献报道。
文献说明，相对于甲苯自溶法，这两种方法提取的酶的活性要高出很多。
SDS抽提法对酵母蔗糖酶的提取效率比较高，是冻融法的2倍，但其中总蛋白量提取也较高，是冻融法的3倍，因此如果采用SDS法，对酵母蔗糖酶的纯化需要去除较多的杂蛋白
本实验结合传统方法和新兴方法，寻找从经济和效率上最优的酵母蔗糖酶的提取工艺
3.3
图3
3.3.2
图4
3.3.3
3.6.2最适温度的测定
在21℃～70℃范围内，设置一系列不同的温度梯度，分别测定各个温度梯度下蔗糖酶的活性，活性最高的温度即为蔗糖酶的最适温度。
表六
管数
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1mol/L蔗糖（ml）
0.1
水（ml）
0.55
缓冲液（ml）
0.25
酶液
200ul
处理温度（1h）
室温（21℃）
25℃
30℃
35℃
40℃
45℃
50℃
55℃
60℃
70℃
DNS（ml）
1.5
沸水浴10min，取出迅速用自来水冷却
水（ml）
10
A540
0
0.179
0.269
0.555
0.747
0.810
0.827
0.796
0.661
0.334
0
0.181
0.267
0.555
0.742
0.811
0.826
0.795
0.658
0.329
0
0.182
0.270
0.554
0.746
——
0.827
0.796
0.658
0.333
A平均
0
0.181
0.269
0.555
0.745
0.810
0.827
0.796
0.659
0.332
3.6.3蔗糖酶Km及Vmax的测定
以蔗糖为底物，在最适条件下，分别设置不同的底物梯度，测定蔗糖酶催化蔗糖的反应速度，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，按双倒数法作图，可以得到Lineweaver–Burk双倒数直线方程，在1/V纵轴的截距是1/Vmax,在1/[S]横轴上的截距是-1/Km，求出Km和Vmax，双倒数方程如下：
表七
管数
1
2
3
4
5
6
7
8
1mol/L蔗糖（ml）
0
0.02
0.03
0.06
0.08
0.10
0.15
0.20
水（ml）
0.6
0.58
0.57
0.54
0.52
0.50
0.45
0.40
缓冲液（PH4.5）（ml）
0.25
酶液（ml）
1
恒温55℃，水浴保温1h
DNS（ml）
1.5
沸水浴10min，取出迅速用自来水冷却
水（ml）
10
A540
0
0.100
0.128
0.347
0.430
0.454
0.816
0.999
0
0.098
0.130
0.343
0.434
0.455
0.817
1.003
A平均
0
0.099
0.129
0.345
0.432
0.455
0.816
1.001
[S]
0
16.95
18.142
22.728
33.247
83.154
580.230
980.302
1/[S]
0.059
0.055
0.044
0.030
0.012
0.002
0.001
V
1.183
1.221
1.397
1.890
2.638
5.747
8.850
1/V
0.845
0.819
0.716
0.529
0.379
0.174
0.113
3.7实验结果与分析
3.7.1离子交换层析图
酵母经过冻融法粗提蔗糖酶、硫酸铵分级沉淀后进行DEAE-Sephrose离子交换层析。
其洗脱曲线如下图，蔗糖酶集中在稳定后一个小时至第二个小时之间。
图5
酵母经过冻融法粗提蔗糖酶、乙醇分级沉淀后进行DEAE-Sephrose离子交换层析。
其洗脱曲线如下图，蔗糖酶集中在稳定后20min至第二个小时结束之间。
图6
3.7.2蔗糖酶的分纯化
计算各步的总蛋白、总活性、比活、回收率和纯化倍数，蔗糖酶比活力为947.805U/mg，最后纯化倍数为16.14倍，回收率为51.6%。
表八
步骤
方法
总蛋白（mg）
总活性（U）
比活性（U/mg）
回收率（%）
纯化倍数
粗提
甲苯自溶法
862.779
44750
28.686
100
1
冻融法
434.104
49500
58.742
100
1
SDS法
511.844
47750
56.262
100
1
一级纯化
乙醇分级沉淀法
冻融法
24.814
34375
385.307
69.4
6.56
SDS法
49.428
36375
335.919
76.2
5.97
硫酸铵分级沉淀法
冻融法
3.985
14750
371.380
29.8
6.32
SDS法
7.762
15625
313.012
32.7
5.56
二级纯化
乙醇沉淀+冻融法
2.685
25667
947.805
51.6
16.14
乙醇沉淀+SDS法
4.477
20600
733.080
43.1
12.48
从上表可以看出，选用乙醇沉淀+冻融法和乙醇沉淀+SDS法是最优组合，但SDS法得到的酶液，容易随时间的改变而变化，见下表；
表九
总活力
比活力
两周前
47750
56.262
两周后
26750
38.471
这极有可能是因为，SDS为强的蛋白质变性剂，随着时间的变化，其对蛋白质的活性有很大的影响，这在酶的生产过程中对周期的要求就大大增加了，而冻融法却没有这种生产限制：
表十
总活力
比活力
两周前
49500
58.742
两周后
48926
57.674
3.7.3蔗糖酶纯度鉴定
图7
1——冻融法+硫酸铵分级沉淀法得到的酶液
2——Marker（由Amersham公司提供）
3——冻融法+乙醇分级沉淀法得到的酶液
4——冻融法+乙醇分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液
5——冻融法+硫酸铵分级沉淀法得到的酶液
6——冻融法+硫酸铵分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液
7——冻融法+乙醇分级沉淀法得到的酶液
8——冻融法+乙醇分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液
9——Marker（由TaKaRa公司提供）
10——冻融法+硫酸铵分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液
从上图可以看出，除了2号泳道和9好泳道有Marker条带，其余没有条带跑出。
初步认为，是由于上样量太少（10uml），但由于存样量不够继续加样实验。
3.7.4酶促反应动力学研究
3.7.4.1最适PH值
用不同PH值的缓冲液体系代替原来的缓冲液体系，然后按常规测定条件和方法测定酶活。
结果表明，酵母蔗糖酶在PH4.5的条件下活性最大（如下图所示）。
图8
3.7.4.2蔗糖酶最适温度
在一系列不同温度下测定蔗糖酶的活性，结果表明，蔗糖酶的最适温度在50℃左右。
（如下图所示）
图9
3.7.4.3蔗糖酶Km及Vmax
在蔗糖酶的最适温度和PH下，测定不同底物浓度时的反应速度，按测定结果计算1/[S]和1/V，并按双倒数法作图，得到线性回归方程（如下图），求得蔗糖酶的Km为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。
图10
第四部分讨论
4.1蔗糖酶的分离纯化
在进行实验之前，根据已有的文献报道和实验室现有的条件设计了一条常规的纯化路线，即粗提、分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析。
在本实验中经过DEAE-Sepharose离子交换层析后，得到了纯的蔗糖酶。
酵母蔗糖酶的提取较常使用甲苯自溶法的，冻融法和SDS抽提法报道较少。
本实验中比较了上述三种酵母蔗糖酶的提取方法（见表八），可以看出SDS抽提法和冻融法的酶活性远高于甲苯自溶法的。
尽管甲苯自溶法所用试剂简单、价格低廉，但由于其耗时长、重复性差、酶活性低等缺陷，提取效率远不如其它两种方法。
通过对不同放置时间相同SDS浓度提取酵母蔗糖酶效果的比较，可以看出（见表九），随着放置时间的增加，酶的总活力和比活力都大大下降了，而冻融法却不然（见表十），随着放置时间的增加，酶的总活力和比活力几乎没变，因此，SDS抽提法在提取酵母蔗糖酶的过程中对操作周期的要求要比冻融法要严格的多！
综合各个资料中对几种物种蔗糖酶的分离纯化实验，一般都是通过乙醇分级沉淀。
乙醇分级沉淀法是指在混合组分的溶液中加人与该溶液能互溶的溶剂，通过改变溶剂的极性而改变混合组分溶液中某些成分的溶解度，使其从溶液中析出。
如在含有糖类或蛋白质的水溶液中，分次加入乙醇,使含醇量逐步增高，逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽在含皂苷的乙醇溶液中分次加入乙醚或丙酮可使极性有差异的皂苷逐段沉淀出来等。
与硫酸铵分级沉淀相比，该方法更简便易行，时间周期要求更短，且对操作温度没有限制，还可以有杀菌的作用。
离子交换层析是分离蛋白质应用最广泛的技术，蛋白质的两性特征意味着他们可以依PH值不同而呈阳离子或阴离子状态存在，与离子交换剂之间进行结合。
因此，蛋白质的洗脱可用离子强度递增的梯度方式进行，也可以用PH梯度方式进行。
由于PH值的变化可能导致酶的失活，故一般用离子强度递增的方法来纯化酶。
蔗糖酶分为酸性蔗糖酶、中性蔗糖酶和碱性蔗糖酶。
本文利用DEAE-Sephardse柱层析后得到的纯蔗糖酶，其最适PH为4.5，应属酸性蔗糖酶，和资料[18]中的实验结果大体上是一致的。
4.2蔗糖酶的酶学性质
实验结果表明，蔗糖酶的最适反应条件为PH4.5，55°C。
反应条件较容易满足，不会给生产厂家带来控制反应条件的压力。
酵母蔗糖酶的Km和Vmax与微生物来源的蔗糖酶进行比较，与其他微生物的相近，和文献中的相近。
但和植物中的Km有一定差别，植物中的Km一般都比微生物中的小，提示植物叶片组织比其他物种具有更强的糖代谢水平，可能是由于在植物的一生都需要蔗糖酶的参与来利用蔗糖等，为植物的生长发育、渗透调节来发挥功能[19]。
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（1）;19-26
致谢
时光飞逝，随着即将到来的论文答辩日子的临近，四年的大学生活即将结束，就要离开这个曾经生活、奋斗了四年的地方，每想及此，心中就有许多的牵挂和舍不得，更有许多的感谢！
首先感谢化工学院给我这次学习的机会，在这几年的学习生活中得到了化工学院的各位老师和领导的大力支持和帮助。
感谢所有教育帮助我的各位老师，是你们给予我的专业知识，为我完成论文打下基础。
本论文是在导师崔志芳教授的悉心指导和严格要求下完成的。
从论文的选题论证，实验方案的确定与实施，实验的进行，论文的构思与撰写，直至定稿，无不倾注导师的大量心血和汗水。
回首大学生活，崔老师务实创新的科研精神、严谨治学的科学态度、高尚的道德情操、兢兢业业的工作作风、平易近人的学者风范，潜移默化的影响着我的人生观、价值观，使我提高了对科学研究的认识，使我在思想上学习上不断前进，恩师在学习上的关怀使我感激至深，在此，谨向崔志芳教授致以最崇高的敬意和最真挚的感谢。
在此感谢师姐季爱云和同学刘娜、尹传志、景新秀、郭兴华、张旭、刘荣明、王雷、宁停波，有了你们的帮助，实验才顺利进行；有了你们的支持，实验过程多了更多的欢声笑语，实验生活不再枯燥。
也在此感谢室友吴少婷以及孙洪林、刘彩平、王云先和宋新妥在学习和生活中给予的关心帮助。
最后还要感谢我的父母和亲人多年来对我学习的关心与鼓励，感谢我的好朋友长期以来给予我的帮助和支持。
任娜
2008-6-5
Immobilizationofinvertaseandglucoseoxidaseinconductingcopolymersofthiophenefunctionalizedpoly（vinylalcohol）withpyrrole
ErtugrulSahmetlioglua,H¨useyinY¨ur¨uka,LeventToppareb,*,IoanCiangac,1,YusufYagcic
aDepartmentofChemistry,NigdeUniversity,51100Nigde,Turkey
bDepartmentofChemistry,MiddleEastTechnicalUniversity,06531Ankara,Turkey
cDepartmentofChemistry,IstanbulTechnicalUniversity,80626Maslak,Istanbul,Turkey
Received22November2004;receivedinrevisedform10August2005;accepted10August2005
Availableonline21September2005
Abstract
Inthisstudy,immobilizationsofinvertaseandglucoseoxidasewereachievedinconductingthiophenefunctionalized
copolymersofvinylalcoholwiththiophenesidegroupsandpyrrole（PVATh/PPy）viaelectrochemicalpolymerization.The
kineticparameters,Vmax（maximumreactionrate
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