人3型腺病毒重组六邻体蛋白的纯化及免疫学研究研究生.docx

人3型腺病毒重组六邻体蛋白的纯化及免疫学研究研究生.docx

《人3型腺病毒重组六邻体蛋白的纯化及免疫学研究研究生.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人3型腺病毒重组六邻体蛋白的纯化及免疫学研究研究生.docx（40页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

人3型腺病毒重组六邻体蛋白的纯化及免疫学研究研究生

目录

中文摘要……………………………………………………………………………2

英文摘要……………………………………………………………………………3

文献综述……………………………………………………………………………4

前言…………………………………………………………………………………13

实验材料……………………………………………………………………………15

实验方法……………………………………………………………………………21

实验结果……………………………………………………………………………27

讨论…………………………………………………………………………………32

结论…………………………………………………………………………………35

参考文献……………………………………………………………………………36

致谢…………………………………………………………………………………41

个人简历……………………………………………………………………………42

中文摘要

目的腺病毒（Adenovirus,AdV）是引起人类呼吸道和消化道感染的重要病原之一，严重威胁着人类的健康。

腺病毒导致小儿肺炎，尤其是6个月至2岁的婴幼儿腺病毒肺炎最为严重，感染主要是以3,5,7型为主,所以建立有效的防治腺病毒感染措施意义重大。

六邻体是腺病毒主要的结构蛋白，能够刺激机体产生相应的抗体，抑制病毒体构象的改变，从而中和病毒体。

本实验组已经成功克隆并表达了重组人3型腺病毒六邻体L1、L2亚基，本次实验旨在纯化重组六邻体亚基蛋白，检测其抗原性、特异性及体外保护情况。

方法在原核表达系统E.coliM15中高效表达重组人3型腺病毒六邻体蛋白。

利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行蛋白纯化。

用纯化的重组六邻体蛋白免疫新西兰家兔,利用免疫印迹技术检测其血清中抗体，鉴定该蛋白的免疫原性和反应原性。

利用固定病毒-稀释血清方法进行中和实验，计算其中和抗体效价。

结果　得到纯化的重组人3型腺病毒六邻体蛋白，该蛋白免疫动物后产生高效价抗体,达到1：

1024000，该抗体能与人3型腺病毒、含有该蛋白的重组工程菌株以及重组六邻体蛋白发生特异性的免疫印迹反应（Westernblot），不与E.coliM15菌株、BSA蛋白、柯萨奇病毒和Hela细胞等反应，证明该重组六邻体蛋白具有良好的免疫原性和反应原性以及3型腺病毒特异性。

在中和实验中，该抗体可以有效地中和人３型腺病毒的感染，中和效价为1:

800，结论　所获得的重组人3型腺病毒六邻体蛋白具有良好的抗原性和特异性,其产生的抗体具有良好的保护作用，为开发研制高效、无毒的腺病毒基因工程疫苗奠定基础。

[关键词]六邻体；纯化；免疫保护；中和抗体

Purificationandstudyontheimmunologyofrecombinanthexonofhumantype-3adenovirus

Abstract

Object:

Theadenovirusoneofthemainpathogenywhichcauserespiratorytractandalimentaryinfectionandcausemoreandmoreserious.Adenoviruscancausechildpneumoniaandthemajorinfectedtypesaretype3,5and7etal，sotoestablishaneffectivesteptopreventionandcureAdenovirusinfectionhasasignificantmeaning.Hexonisthemajorstructureproteinofadenovirus.Itstimulatesthebodytoproduceanti-bodyandinhibitsconstructshiftofvirustoneutralizethevirusbodyitself.wehavealreadyclonedandexpressedtherecombinanthexonofhumantype-3adenovirus.Nowweintendtopurifytherecombinanthexonofhumantype-3adenovirusanddetectitsantigenicity、specificityandconservationexvitro.Methods：

Undertheoptimumexpressionconditions,thehexonproteinofhumantype3adenoviruswasefficientlyexpressedinEColi.TheexpressedproteinswerepurifiedbymeansofNi-NTAaffinitychromatography.Usingthepurifiedhexontoimmunerabbitandtestthehexon’santigenicitywiththemethodofWestern-blottechnique.totest　neutralizationantibodybymeansoffixedvirus-dilutedserum　way.Results：

Thehexonofhumantype3adenoviruswaspurifiedandwasprovedtoimmunetherabbitwithhighantibodytiter（1:

1024000）andtheantibodyreactedspecificwiththepurifiedrecombinanthexon,notreactedwithE.coli、BSA、CoxsackievirusandHelacell,therecombinantE.colistraincontainingthehexonproteinandthetype3adenovirusitself.Thusitwasprovedthattherecombinantproteinpossessedbothofthehighantigenicityandhighspecificitytotype3adenovirus.InNAtest,theantibodycanneutralizeadenoviruseffectivelyanditsneutralizationantibodytiteris1：

800.Conclusions：

Therecombinanthexonhashighimmunogenicityandreactionogenicityandspecificity.It’santibodyhasremarkableprotection.Thisisveryimportanttoproduceeficientandnontoxicgeneticengineeringvaccineagainstadenovimsinfection

Keywords：

hexon,proteinpurification,immunogenicity,neutralizationantibody

文献综述

腺病毒（Adenovirus,AdV）是引起人类呼吸道和消化道感染的重要病原之一，严重威胁着人类的健康[1]。

在<5岁儿童的急性呼吸系统疾病中，腺病毒引起的肺炎较为严重；在3岁以下儿童还易引起急性肺炎，以3，5，7型为主[2]。

近些年在北方地区曾有过腺病毒的暴发流行，严重地威胁着儿童的健康和生命安全，因此，对腺病毒进行快速、特异性诊断和预防具有重大意义。

腺病毒六邻体是腺病毒的主要抗原，刺激机体产生抗体，抑制病毒体构象的改变，从而中和病毒体[3]。

本文综述了近些年来腺病毒的国内外研究现状，对其致病性、一般特征、免疫学特性、疫苗及应用进行探讨。

一.腺病毒（Adenovirus,AdV）是引起人呼吸道和消化道感染的重要病原之一。

腺病毒肺炎是由腺病毒感染肺部引起的肺炎,是病毒性肺炎中最严重的一种。

它是由3型和7型腺病毒所引起的,主要是由腺病毒造成的气管、支气管上皮广泛坏死,引起支气管管腔闭塞,致使病情加重,最终导致肺功能损害和其他功能障碍。

不少危重患儿虽然经过抢救挽回了生命,但由于肺组织破坏较重,遗留不同程度的慢性肺部疾病,如支气管扩张症等,对儿童的健康危害极大[4]。

肠腺病毒（entericadenovirus）是婴幼儿腹泻的重要病原体。

属于普通腺病毒的40,41血清型,外形与普通腺病毒相同,为直径70～80nm的双链DNA病毒,主要侵犯婴幼儿,通过人与人的接触传播,也可经粪—口途径及呼吸道传播[5]。

本病无明显季节性,夏秋季略多,可呈暴发流行。

临床表现为较重的腹泻,稀水样便,每日3～30次。

常有呼吸道症状。

如咽炎、鼻炎、咳嗽等,发热及呕吐较轻,可有不同程度的脱水征。

病程8～12d。

多数患儿病后5～7个月内对蔗糖不耐受,并可伴有吸收不良。

二、腺病毒的分类及其一般特征

腺病毒在自然界分布十分广泛，存在于各种动物体内,分为感染鸟类（Aviadenovirus）和哺乳动物（Mastadenovirus）的两个属。

后者从9种不同的宿主中共分离到101种,其中研究最广泛的是人腺病毒。

目前,人类腺病毒共发现51种血清型[6]（以英文字母和数字表示）,可分为A～F六个亚属。

它们在组织趋向性等方面都有着不同的特性[7]。

A～E各组型病毒能在人的组织细胞（肾细胞）常规培养中增殖,称为普通腺病毒,F组的40、41型病毒是从粪便中发现用常规细胞培养不能增殖的腺病毒,称为肠道腺病毒。

有些腺病毒在动物体内可致瘤，在体外能转化细胞[8]。

腺病毒无包膜，20面体对称，直径为70～90nm，有252壳粒，其中20面顶角壳粒为12个五邻体（penton，82KD），每个五邻体有2条纤维，长度相同或不同纤维上带有主要的种特异性抗原决定簇和次要的亚属特异性抗原决定簇。

除五邻体外有240个非顶角壳粒，称为六邻体（Hexon,120KD），后者带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇[9]（图一）。

图一、腺病毒的结构

Fig1.Structureofadenovirus

腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体（Stewartetal.,1993）。

其病毒壳体含有三种主要的蛋白：

六邻体（II），五邻体基底（III）和纤突（IV），还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2（Fig.1）。

腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，其5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合，5’端上还具有末端反向重复序列（ITRs）。

病毒DNA与核心蛋白VII和一个称为mu的小肽紧密结合。

另一种蛋白V包被在DNA-蛋白复合物上，并且通过蛋白VI为DNA-蛋白复合物和病毒壳体间提供了结构上的联系[10]。

病毒含有一种病毒自身编码的蛋白酶，这种蛋白酶对于加工某些结构蛋白从而产生成熟的具有感染性的病毒是必需的[11]。

　　腺病毒家族（Adenoviridae）的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。

因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，并且高效率地复制，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者[12，13]。

三、六邻体蛋白的结构和功能

目前,已对六邻体蛋白（图二）进行了广泛的结构和功能的研究[14]。

每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体，是大于900个残基的复杂蛋白[15]。

三聚体的六邻体分子有一个五面体的基底和三角形的塔尖，基底包含两个区域P1、P2区，经过对Ad2电子显微镜观察和x线衍射分析，P1、P2在内部卷曲成8个稳定的β折叠反向平行结构,塔区由三个环构成Loop1、Loop2、和Loop4。

通过用一组单克隆抗体来检测不同型的纯化的六邻体蛋白表明，在六邻体表面有许多的抗原决定簇存在在这几个环上。

对Loop1、Loop2、Loop4进行了研究，其中Loop2、Loop4卷曲成团，和三聚体中的其它两个多肽链的相应区域相互作用,环间相互指状突起使得三聚体的结构相当稳定[16]。

Loop1是最长、最复杂的环，自身折叠许多倍，向外突起最大限度的与周围环境相互作用。

对15个不同型的腺病毒的六邻体蛋白的核酸序列研究表明基底的P1、P2区是保守的，变化区主要集中在Loop1、Loop2区[17]。

Loop1、Loop2的所对应的氨基酸是1419—1428个氨基酸，其中有250个变化的残基，存在有七个独特的超变区（HVR），在这七个HVRS中，HVR1~HVR6出现在Loop1中，HVR7在Loop2的塔尖。

这些HVRS在不同的血清型之间的长度有所不同，变化范围在2~38个氨基酸之间。

其中HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7中含有中和抗原决定簇的一部分[18]，而且抗原决定簇的至少包括两个或两个以上的HVRS。

在这五个HVRS中包括大于99%的六邻体型特异性残基。

在Loop1、Loop2当中，这些保守性残基形成HVR区的框架，代表着临近区域的不连续链的相互作用，2/3的保守序列是疏水性的更说明它们承担的是结构功能。

在HVRS区中，HVR1、HVR6是Loop1内部支持区，而且HVR1是残基变化最多的区域。

HVR4、HVR5是Loop1的主要外部支持区，HVR5位于塔尖，塔区的重量变化主要由这两个区域来决定。

目前，这五个HVRS区相应的氨基酸序列以及所对应的核苷酸序列已经确定。

由于这五个HVRS位于Loop1、Loop2,所以Loop1、Loop2是较好的中和抗原决定簇[19]。

图二、六邻体蛋白的结构

Fig2.Structureofhexon

六邻体是病毒的主要抗原蛋白,含有大量的抗原表位,如型、型间及组特异性抗原表位及中和性表位。

但大部分抗原表位在蛋白的一级结构上还没有被确切定位[20]。

不同型别的六邻体有很高的保守（78%～95%）[21]，型间与组特异性抗原表位定位于这些保守的区域，可能具有一定的抗原性，可作为病毒感染性疾病诊断的靶抗原位点。

在六邻体的前段和中段,有大量的抗原性高峰及较密的亲水性高峰区域。

该区域含有大量的保守区，可能具有较强的抗原性及很好的暴露性，并期望能够作为型间特异性表位，诱导高效价的抗HAdV特异性抗体。

六邻体的后段主要由环4、P2区组成，尽管该区域在病毒颗粒上亦有较好的抗原暴露性，并且序列的同源性较高，但疏水性氨基酸残基较多。

抗原性预测分析显示，六邻体后段的抗原性高峰较稀少，相反，疏水性高峰多而密，提示该区域的总体抗原性较弱。

四、腺病毒血清型的确定

腺病毒血清型的确定是根据感染性中和反应，它是型特异性，直接针对六邻体蛋白的中和抗原决定簇。

血清型又根据核苷酸的同源性、纤维蛋白的特性以及生物学特性来区分为六个亚型（A、B、C、D、E、F）另据研究发现，在这几个中和抗原决定簇所在的几个超变区HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7当中，发生了广泛的染色体的非正常重组[22]，包括短的直接重复序列的缺失、插入、重叠。

而且Adv血清型的进化是由于在HVRS中发生非正常的重组（抗原行迁移），并伴随有单一碱基的突变。

，而且六邻体蛋白的血清特异型也位于Loop1、Loop2的七个HVRS中。

在HVRS的重组又形成独特的新的血清型，这种独特的血清型由组成中和抗原决定簇的残基的数目、位置、生物学特性所决定。

此处需要指出的是血清型的鉴定不局限于中和反应，有研究者利用限制性酶切分析，鉴定特异性区域（SSR）来确定血清型，而且所需的时间比中和反应所需的时间少的多，前者只需一周，后者要三周，最后二者的结果完全相同。

也有人利用六邻体蛋白的一个结构部分pIX进行亚型的鉴定，pIX是14.3KDa六邻体很小的组成蛋白，它位于每个六邻体壳粒的中间，C末端序列暴露在壳粒表面，N末端伸向壳粒内部，pIX的作用是作为一个粘性因子连接六邻体—六邻体，而且它在DNA包装的过程中也起到重要作用。

pIX的核甘酸序列在不同的亚型间表现出明显的差别。

有研究小组设计特异的引物，应用聚合酶链反应（PCR），可以是全部的pIX基因以亚型特异的方式进行扩增，说明利用pIX进行PCR分析，有助于腺病毒亚型的鉴定[23,24]。

另据研究发现，在这几个中和抗原决定簇所在的几个超变区HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7当中,发生了广泛的染色体的非正常重组，包括短的直接重复序列的缺失、插入、重叠。

而且Ad血清型的进化是由于在HVRs中发生了染色体非正常的重组（抗原性迁移），并伴随有单一碱基的突变。

HVRs的重组又形成了独特的新的血清型，这种独特的血清型由组成中和抗原决定簇的残基的数目、位置、生物学特性所决定。

五、六邻体的免疫学反应

为了研究腺病毒衣壳的三个主要成分所引起的免疫反应，将复制缺陷型腺病毒（Rec-Ad）注射到BALB/C小鼠体内进行研究。

实验结果表明，采用不同的免疫方式，产生的免疫反应有所不同。

通过iv途径进行免疫，产生anti-Fi（抗纤维）、anti-Pb（抗五邻体）、anti-Hx（抗六邻体）的抗体；通过ip途径进行免疫，则可以产生anti-Hx抗体。

由此表明腺病毒有三个结构性抗原[25]，抗体可以与其结合，发生感染性失活：

这些抗原分别是纤维、五邻体、六邻体。

Anti-Fi抗体的作用主要是聚集病毒体；Anti-pb抗体的中和作用是阻断酸性细胞进入细胞浆；Anti-Hx抗体，既可以通过聚集病毒体起中和作用又可以在低PH值（PH5.0-PH6.0）下部分抑制病毒体的构象改变，从而中和病毒体[26]。

病毒的六邻体包膜在最初的感染阶段起着很大的作用，在PH值降低的情况下，六邻体蛋白发生构象的改变，暴露出分子的N-端。

PH值诱导的六邻体构象的改变，对于以后五邻体基底的暴露，或是参与病毒体脱去包膜是很必要的[27]。

1983年，有研究人员认为六邻体蛋白为型特异性抗原决定簇，是中和抗原的靶点，是病毒体对免疫选择压力最敏感的部分。

它的特异型很可能氨基酸的靶序列决定[28]。

为了研究不同腺病毒六邻体的抗原决定簇的组成，应用61个小鼠腹水（包含Mab），分为三组进行。

其中不同的抗原决定簇的分布和标志由Mab进行识别。

在研究抗原决定簇组成的过程中，反应型和所有的61个Mab的滴度间接由ELISA来确定[29]。

由Mab识别的抗原决定簇是六邻体型特异性抗原决定簇。

用Mab来区分21个不同的六邻体，这61个Mab用交叉反应类型和滴度的相关系数进行处理，由此识别出25个抗原决定簇类型，而且型特异性表位只存在于同源六邻体的表面[30]。

有研究表明，anti-Hx抗体有着极强的中和反应，而且anti-Fi和anti-pb抗体在anti-Hx抗体所获得的中和反应上有着协同效应，而且在由iv中可以引起最强的中和反应活性。

Anti-Fi抗体虽然存在，但是它们不能有效的阻断病毒感染，所以说纤维蛋白不是一个很强的中和抗原决定簇，只具有很弱的免疫原性。

腺病毒的中和抗原决定簇主要在于六邻体上，在当六邻体被替代或突变将会导致中和免疫反应的缺失。

因为六邻体作为腺病毒的主要结构蛋白，参与各种各样的复杂蛋白的相互作用[31]。

有研究者应用比色法进行中和反应的分析。

用于定量测定Adv抗体的血清学滴度；在血清学的流行病研究中筛选型特异性中和抗体。

尤其当抗体的水平低于50-80%时，用比色法来确定低水平感染更为有效。

使用这种方法来大规模地筛选血清和Mab，以获得存在血清标本中的中和抗体值[32]。

六、疫苗的研究

八十年代，在军队中广泛应用Ad7作为减毒活疫苗，来预防呼吸道疾病和眼疾病[33]。

有人研究过应用六邻体亚单位通过阴离子交换层析纯化，以获得纯化的牛型腺病毒Ⅲ型的六邻体免疫—刺激复合体进行免疫，它可以在兔和牛体内诱导产生中和抗体。

由此表明BAV-3六邻体可以制备成多价亚单位疫苗，保护牛抵抗多种呼吸道疾病[34]。

目前国际上主要集中研制腺病毒的基因工程疫苗。

病毒的复制及病毒基因表达的减少，对于开发活疫苗和用做基因疗法的载体是所必要的。

例如，细胞毒性基因的失活，对于产生减毒活疫苗是很有意义的[35]。

在转导细胞内减少病毒基因的表达，可以导致病毒载体安全性增加。

在腺病毒体内，病毒基因的复制和病毒基因的表达可以通过转换控制因素，启动子的替换来减少。

曾有人通过E4启动子的转换，使启动子功能减少，减少病毒后期基因的表达。

在H1229细胞内，通过E4启动子的替换而构建的载体，所诱导表达的纤维，与野生型相比，大大减少[36]。

随着分子生物学技术的开展，对腺病毒的基因工程疫苗的研究也开展了起来。

国际上，有人应用Ad2的loop1区的抗原决定簇在B组苛萨奇病毒中的表达。

以苛萨奇病毒作为载体，重组腺病毒六邻体蛋白的L1环，以使其在HeLa细胞内稳定地表达，所表达的蛋白，可以诱导产生既抗腺病毒又抗苛萨奇病毒的中和抗体，进而研制多价的基因工程疫苗[37,38]。

七、病毒感染的特异性免疫

（一）体液免疫作用

病毒的抗体可自感染者血清中检出，因此较早被发现并进行了较深入的研究。

病毒感染后最先出现的是IgM类特异抗体，一般在感染后2～3d血清中开始出现[39]。

以后则出现IgG类抗体，并随不同病毒种类而持续时间长短不等。

一般经粘膜感染并在粘膜上皮细胞中复制的病毒在局部可诱生IgA类抗体。

特异性抗体可用于诊断。

在体内，中和抗体的抗病毒作用至为重要。

1、中和抗体这种抗体能与病毒结合后消除病毒的感染能力，故在杀灭细胞外的游离病毒中起主要作用。

其作用机制是改变病毒表面构型，或与吸附于易感细胞受体的病毒表位结合，阻止病毒吸附并侵入易感细胞和增殖。

病毒与中和抗体形成的免疫复合物更容易被巨噬细胞所吞噬、清除或改变抗原递呈途径。

有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可致病毒裂解。

IgG、IgM、IgA三种不同类型免疫球蛋白的中和抗体具有不同的生物学特性。

由于IgG分子量小，通过胎盘，新生儿可具有来自母体的中和抗体而得到约6个月的被动免疫保护期。

IgM因分子量大，不能通过胎盘。

如在新生儿血中测得被动特异性IgM抗体，可诊断为宫内感染。

病毒感染后最早出现IgM抗体，故检查IgM抗体可作早期诊断。

IgA抗体主要来源于粘膜固有层的浆细胞，存在于粘膜分泌液中，在局部免疫中起主要作用，常可阻止病毒的局部粘膜入侵。

2、非中和抗体有些抗体是针对有包膜病毒的基质或其中的核蛋白，有些抗体是针对病毒表面具有细胞融合功能的酶或病毒复制酶等。

因这类抗原与病毒入侵易感细胞不相关，故相应抗体无中和作用，但有时具有诊断价值。

病毒抗体的诊断方法随不同病毒而异。

3、抗体介导对靶细胞的作用因有包膜的病毒感染细胞后，细胞膜可出现病毒编码的蛋白，能与相应抗体结合，在补体参与下裂解细胞；也可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）裂解与破坏病毒感染的细胞。

4、抗体介导促进作用（enhancement）抗体与某些病毒结合后，可促进病毒在感染细胞中的复制，如登革病毒、呼