流式细胞术临床检测项目操作流程.docx
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流式细胞术临床检测项目操作流程
临床检测项目操作流程
1：
淋巴细胞亚群测定
2：
HLA-B27测定
3：
CD55／CD59测定
4：
血小板抗体测定
5：
红细胞抗体测定
6：
粒细胞抗体测定
7：
白血病免疫分型测定
8：
淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定
9：
XL操作步骤
淋巴细胞亚群测定
（CD系列）
方法
流式细胞仪（BD）
原理：
双/三色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。
淋巴细胞表面抗原分布如下：
T淋巴细胞：
CD3+；B淋巴细胞：
CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：
CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：
CD3+CD8+；NK细胞：
CD3-CDl6+56+等。
根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。
标本采集与处理
受检者的准备：
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。
抗凝剂：
EDTA或肝素抗凝血
要求：
1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。
试剂
品牌 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1：
单克隆抗体 1ML 2—8℃
2：
全血溶血试剂
A：
甲酸 70ML 室温
B：
碳酸钠等 32ML 室温
C：
多聚甲醛 14ML 室温
3：
鞘液 20L 室温
4：
清洗液 5L 室温
5：
荧光微球 10ML 2-8℃
质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：
遇特殊情况随时进行校准。
样本制备：
1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照
2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟。
4）溶血：
FACSLYSINGSOLUTION（按说明书步骤溶血）。
5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样。
操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％
灵敏度 500—1000个荧光素分子
参考值（百分数（绝对值））
CD3+ 60.8-75.4%（1141-1880） CD4+ 29.4-45.8%（478-1072）
CD8+ 18.2-32.8%（393-742） NK 9.5-23.5% （175-567）
Th/Ts 1.05-2.03
临床意义
1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。
临床常用Th/Ts比值来判断病人的免疫状况。
Th／Ts比值升高：
表示免疫功能亢进：
见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。
Th／Ts比值减低：
表示免疫功能下降：
艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。
2：
NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。
NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。
NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。
HLA-B27测定
原理：
双色直接免疫荧光法。
将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。
样本制备：
1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照
2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟。
4）溶血：
FACSLYSINGSOLUTION（按说明书步骤溶血）。
5）洗、离心、上机测样（备注：
测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）
报告结果
报告阴阳性
参考值
阳性：
HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。
临床意义
HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。
CD55/CD59测定
原理：
双色直接免疫荧光法。
近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。
血细胞（红细胞和白细胞）通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。
用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。
样本制备:
（一）白细胞CD55／CD59检测
1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。
分别向二管中加入样品100ul。
2．溶血。
3．离心后分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。
避光20-30分钟。
4．洗涤离心
5．上机测样
（二）红细胞CD55／CD59检测
1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记
2．分别加入CD55／CD5910ul和相应的同型对照10ul。
3．向二管中加入1：
200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。
4．洗涤离心。
5．混匀、上机测样。
报告结果
报告百分数
参考值
CD55>97% CD59>97%
PNH的临界值：
RBC CD59>95% WBC CD59>90%
PNH的诊断值：
RBC CD59>91% 大部分>80%
中性粒细胞CD59>84%
临床意义
用于AA和PNH的诊断和分型诊断。
PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。
血小板膜表面抗体测定
原理：
直接免疫荧光法。
FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。
操作：
富集血小板法：
1）800r/min*15min,取上清，
2）加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。
3）分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照（IgG-FITC）
4）分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。
）。
5）混匀，避光，室温孵育20-30分钟
6）洗或不洗，上机测样
全血法：
1）加4－5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）－6）
报告结果
报告百分数
参考值
IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91%
临床意义
为免疫性血小板减少性紫癜（ITP）诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。
红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）
原理：
直接免疫荧光法。
FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。
操作：
1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照（IgG-FITC）
2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：
200稀释后）。
3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟
4）上机测样
报告结果
报告百分数
参考值
IgA<2.78% IgG<2.98% IgM<2.52% IgD<2.88%
临床意义
自身溶血性贫血的分型诊断
粒细胞抗体测定
原理：
直接免疫荧光法。
FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析
1）溶血
2）分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照（IgG-FITC）
3）分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。
4）混匀，避光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心
5）上机测样
报告结果
报告百分数
参考值
IgA<2.68% IgG<2.66% IgM<2.49% IgD<3.4%
临床意义
白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性
白血病免疫分型测定
原理：
三色直接免疫荧光法。
正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。
利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。
三色染色在白血病免疫分型中较为常用。
根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。
抗凝剂 肝素抗凝
要求 1．样本量至少3ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。
4．溶血样本不能用。
操作-样本制备：
细胞膜表面抗原
1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。
2．首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。
3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul（注意：
必须是FITC和PE标记的抗体搭配）
4．各管中加入标本（骨髓或外周血）30～100u1（根据细胞的多少决定），振荡混匀，室温避光20～30分钟。
5．溶血：
细胞浆和核抗原
1．准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。
2．首先每管中加入标本（骨髓或外周血）100ul（根据细胞的多少决定），5ulCD45-PC5抗体。
室温避光20分钟。
3．每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。
4．各管中加入PBS4ml。
5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。
（1500r/min*5min）
6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。
8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。
9．300g离心5分钟后，弃去上清液。
10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。
11．上机测样
报告结果：
报告百分数
参考值
CD34+<5% MPO+<5%
粒系<20% 淋系<30%
临床意义
用于血液病的诊断和分型诊断
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
原理：
直接免疫荧光法。
肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养（辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。
淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。
因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量），然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。
试剂
淋巴细胞培养体系（自配）
成分：
刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。
单克隆抗体
CD4—PC5、IL-4-PE、IFN-γ-FITC
操作：
细胞培养与染色
取200ul抗凝血加入lOulCD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5％C0237℃孵育18小时，取出后以PBS洗一次。
用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。
将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。
流式细胞仪测定
打开流式细胞仪及氩激光光源（488nm）预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光（FS）和测向散射光（SSC）散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。
●淋巴细胞在FS／SSC散点图中位置，即A门内细胞；
●A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞；
●B门内TH细胞亚群分布：
1区数值---Th1细胞 （%）
4区数值---Th2细胞 （%）
2区数值---Th0细胞 （%）
报告结果 ：
报告百分数
正常参考值
Thl（IFN-γ）：
17.39±5.52% Th2（IL-4）：
1.50±0.44%ThO：
0.51±0.26%
临床意义
淋巴细胞均分泌多种细胞因子：
Thl细胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-γ和TNF-b／a等，Th2细胞主要分泌IL-4．IL-5．IL-6，IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。
Thl为IFN-γ+，Th2为IL-4+。
静息状态（人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-γ和IL-4也微乎其微。
当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。
本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。
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