流式细胞术临床检测项目操作流程.docx
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流式细胞术临床检测项目操作流程
临床检测项目操作流程
1:
淋巴细胞亚群测定
2:
HLA-B27测定
3:
CD55/CD59测定
4:
血小板抗体测定
5:
红细胞抗体测定
6:
粒细胞抗体测定
7:
白血病免疫分型测定
8:
淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定
9:
XL操作步骤
淋巴细胞亚群测定
(CD系列)
方法
流式细胞仪(BD)
原理:
双/三色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到淋巴细胞亚群的百分数。
淋巴细胞表面抗原分布如下:
T淋巴细胞:
CD3+;B淋巴细胞:
CD5+,CDl9+;辅助性T淋巴细胞:
CD3+CD4+;抑制性T淋巴细胞:
CD3+CD8+;NK细胞:
CD3-CDl6+56+等。
根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同,流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群,利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。
标本采集与处理
受检者的准备:
检查对象生活饮食处于日常状态,空腹静脉采血。
抗凝剂:
EDTA或肝素抗凝血
要求:
1.样本量至少1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L, 样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核细胞。
4.溶血样本不能用。
试剂
品牌 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1:
单克隆抗体 1ML 2—8℃
2:
全血溶血试剂
A:
甲酸 70ML 室温
B:
碳酸钠等 32ML 室温
C:
多聚甲醛 14ML 室温
3:
鞘液 20L 室温
4:
清洗液 5L 室温
5:
荧光微球 10ML 2-8℃
质控品BD产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:
遇特殊情况随时进行校准。
样本制备:
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟。
4)溶血:
FACSLYSINGSOLUTION(按说明书步骤溶血)。
5)上机测样(可根据样本情况选择洗或不洗上样。
操作性能
精密度 批内五次重复CV<2%
灵敏度 500—1000个荧光素分子
参考值(百分数(绝对值))
CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072)
CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)
Th/Ts 1.05-2.03
临床意义
1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标,在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染,自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。
临床常用Th/Ts比值来判断病人的免疫状况。
Th/Ts比值升高:
表示免疫功能亢进:
见于自身免疫性疾病,如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。
Th/Ts比值减低:
表示免疫功能下降:
艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。
2:
NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞,所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。
NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂,疲劳综合征病人等,NK活性随年龄增长而减退。
NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应,白介素-2治疗后;外周血NK细胞增加。
HLA-B27测定
原理:
双色直接免疫荧光法。
将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应的抗体结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。
样本制备:
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟。
4)溶血:
FACSLYSINGSOLUTION(按说明书步骤溶血)。
5)洗、离心、上机测样(备注:
测B27一定要至少洗一遍方可上机检测)
报告结果
报告阴阳性
参考值
阳性:
HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。
临床意义
HLA复合体位于第6号染色体的短臂上,该区DNA片段长度约3000-4000KB,占人体整个基因的1/3000,HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因,与多种疾病具有相关性,尤其是强直性脊柱炎。
CD55/CD59测定
原理:
双色直接免疫荧光法。
近年的研究表明,红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。
血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。
用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。
样本制备:
(一)白细胞CD55/CD59检测
1.准备2支流式细胞仪专用管,分别标记。
分别向二管中加入样品100ul。
2.溶血。
3.离心后分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。
避光20-30分钟。
4.洗涤离心
5.上机测样
(二)红细胞CD55/CD59检测
1.准备2支流式细胞仪专用管,分别标记
2.分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。
3.向二管中加入1:
200稀释的样品100ul(可根据红细胞的数量调整),避光20-30分钟。
4.洗涤离心。
5.混匀、上机测样。
报告结果
报告百分数
参考值
CD55>97% CD59>97%
PNH的临界值:
RBC CD59>95% WBC CD59>90%
PNH的诊断值:
RBC CD59>91% 大部分>80%
中性粒细胞CD59>84%
临床意义
用于AA和PNH的诊断和分型诊断。
PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。
血小板膜表面抗体测定
原理:
直接免疫荧光法。
FITC标记的各型多克隆抗体,加到经离心富集的血小板中,与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合,经过洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析。
操作:
富集血小板法:
1)800r/min*15min,取上清,
2)加4-5ml鞘液,2000r/min*3min,弃上清,重复一次。
3)分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)
4)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS(血小板的量约为106)(血小板若在正常范围,稀释到原量直接取10u1。
)。
5)混匀,避光,室温孵育20-30分钟
6)洗或不洗,上机测样
全血法:
1)加4-5ml鞘液,1500r/min*15min,弃上清,后同上3)-6)
报告结果
报告百分数
参考值
IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91%
临床意义
为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标,在ITP、胶原性疾病时升高。
红细胞膜蛋白结构测定(红细胞抗体)
原理:
直接免疫荧光法。
FITC标记的各型多克隆抗体,加到全血中,与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合,经过洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析。
操作:
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血(1:
200稀释后)。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟
4)上机测样
报告结果
报告百分数
参考值
IgA<2.78% IgG<2.98% IgM<2.52% IgD<2.88%
临床意义
自身溶血性贫血的分型诊断
粒细胞抗体测定
原理:
直接免疫荧光法。
FITC标记的各型多克隆抗体,加到经溶血处理后的样本中,与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合,经过洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析
1)溶血
2)分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)
3)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。
4)混匀,避光,室温孵育20-30分钟,洗涤离心
5)上机测样
报告结果
报告百分数
参考值
IgA<2.68% IgG<2.66% IgM<2.49% IgD<3.4%
临床意义
白细胞减少症的分型诊断,大多数白细胞减少症患者抗体为阳性
白血病免疫分型测定
原理:
三色直接免疫荧光法。
正常血细胞的分化成熟过程中,细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关,因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。
利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色,通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析,由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。
三色染色在白血病免疫分型中较为常用。
根据分型需要,选择相应抗原的标记抗体,一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组,再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体,共三种抗体加入一管
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,腰穿采骨髓。
抗凝剂 肝素抗凝
要求 1.样本量至少3ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L, 样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核 细胞。
4.溶血样本不能用。
操作-样本制备:
细胞膜表面抗原
1.首先准备所需的管,并在管上标记上欲加入的抗体。
2.首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。
3.然后,按管上的标记,加入相应抗体各10ul(注意:
必须是FITC和PE标记的抗体搭配)
4.各管中加入标本(骨髓或外周血)30~100u1(根据细胞的多少决定),振荡混匀,室温避光20~30分钟。
5.溶血:
细胞浆和核抗原
1.准备所需的管,并在管上标记上欲加入的抗体,其中一管是同型对照。
2.首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定),5ulCD45-PC5抗体。
室温避光20分钟。
3.每管中加入固定液100ul,剧烈振荡混匀,室温避光15分钟。
4.各管中加入PBS4ml。
5.300g离心5分钟后,弃去上清液,振荡混匀。
(1500r/min*5min)
6.各管中加入透膜剂100ul,轻轻混匀,室温避光5分钟。
7.加抗体,阴性对照管中加入10ul,其余各管加入相应抗体各10ul,室温避光15分钟。
8.各管中加入4mlPBS,振荡混匀。
9.300g离心5分钟后,弃去上清液。
10.各管中加入PBS500ul,振荡混匀。
11.上机测样
报告结果:
报告百分数
参考值
CD34+<5% MPO+<5%
粒系<20% 淋系<30%
临床意义
用于血液病的诊断和分型诊断
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
原理:
直接免疫荧光法。
肝素钠抗凝全血在PMA,Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。
淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子,且迅速分泌到细胞外。
因此,利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞,然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外,使细胞因子在细胞内滞留到一定的量),然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色,使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。
试剂
淋巴细胞培养体系(自配)
成分:
刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。
单克隆抗体
CD4—PC5、IL-4-PE、IFN-γ-FITC
操作:
细胞培养与染色
取200ul抗凝血加入lOulCD4-PC5单抗,室温避光孵育30分钟,RPMIl640洗涤一次,将细胞加入培养体系中,5%C0237℃孵育18小时,取出后以PBS洗一次。
用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。
将细胞分成两管,其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC,另一管加入同型对照,室温避光20分钟,PBS洗涤一次,待测。
流式细胞仪测定
打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min,同时仪器自动初始化;用标准荧光微球校正光路和流路,然后依次检测标本,每份标本检测50000以上细胞,在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群,然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。
●淋巴细胞在FS/SSC散点图中位置,即A门内细胞;
●A门内CD4阳性细胞,即B门内细胞;
●B门内TH细胞亚群分布:
1区数值---Th1细胞 (%)
4区数值---Th2细胞 (%)
2区数值---Th0细胞 (%)
报告结果 :
报告百分数
正常参考值
Thl(IFN-γ):
17.39±5.52% Th2(IL-4):
1.50±0.44%ThO:
0.51±0.26%
临床意义
淋巴细胞均分泌多种细胞因子:
Thl细胞主要分泌IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-b/a等,Th2细胞主要分泌IL-4.IL-5.IL-6,IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子,IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子,所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。
Thl为IFN-γ+,Th2为IL-4+。
静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱,在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞,这时我们所能检测的胞内的IFN-γ和IL-4也微乎其微。
当Th细胞受到外界因素,如刺激素、病原体等刺激,其中Th0即会向Thl或Th2大量分化,此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。
本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。