流式细胞术临床检测项目操作流程.docx

1、流式细胞术临床检测项目操作流程临床检测项目操作流程1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法 流式细胞仪(BD)原理：双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：

2、CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。标本采集与处理受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求：1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。4溶血样本不能用。试剂品牌 规格 贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗

3、体 1ML 28 2：全血溶血试剂A：甲酸 70ML 室温B：碳酸钠等 32ML 室温C：多聚甲醛 14ML 室温3：鞘液 20L 室温4：清洗液 5L 室温5：荧光微球 10ML 2-8质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。样本制备： 1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟。4) 溶血：FACS LYSING SOLUTION (按说明书步骤溶血)。5) 上机测样（可根据样本情况选

4、择洗或不洗上样。操作性能 精密度批内五次重复CV97%CD5997% PNH的临界值：RBCCD5995%WBCCD5990% PNH的诊断值：RBCCD5991%大部分80%中性粒细胞CD5984%临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。血小板膜表面抗体测定原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。操作： 富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加45ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，

5、重复一次。3) 分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)4) 分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。）。5) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟6) 洗或不洗，上机测样全血法：1）加45ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）6）报告结果 报告百分数参考值IgA2.98%IgG3.04% IgM3.0% IgD2.91%临床意义为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）原理

6、： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。操作： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：200稀释后）。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)上机测样报告结果 报告百分数参考值IgA2.78%IgG2.98% IgM2.52%IgD2.88%临床意义自身溶血性贫血的分型诊断粒细胞抗体测定原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的

7、相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析1) 溶血2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)3)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。4)混匀，避光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心5)上机测样报告结果 报告百分数参考值IgA2.68%IgG2.66%IgM2.49%IgD10.0109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核 细胞。4溶血样本不能用。操作-样本制备：细胞膜表面抗原1首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。3然后，按管上

8、的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)4各管中加入标本(骨髓或外周血)30100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光2030分钟。5溶血：细胞浆和核抗原1准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4各管中加入PBS4ml。5300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。

9、 7加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。8各管中加入4mlPBS，振荡混匀。9300g离心5分钟后，弃去上清液。10各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11上机测样报告结果：报告百分数参考值 CD34+5%MPO+5% 粒系20% 淋系30%临床意义用于血液病的诊断和分型诊断T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4检测原理： 直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此

10、，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量)，然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-和IL-4进行测定。试剂淋巴细胞培养体系(自配)成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。单克隆抗体 CD4PC5、IL-4-PE、IFN-FITC操作： 细胞培养与染色 取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5C02 37孵育18小时，取出后以PBS洗一次

11、。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定 打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-FITC的表达。淋巴细胞在FSSSC散点图中位置，即A门内细胞；A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞；B门内TH细胞亚群分布： 1区数值-Th

12、1细胞(%)4区数值-Th 2细胞(%) 2区数值-Th 0细胞(%)报告结果：报告百分数正常参考值Thl(IFN-)：17.395.52% Th2(IL-4)：1.500.44% ThO ：0.510.26%临床意义淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-和TNF-ba等，Th2细胞主要分泌IL-4IL-5IL-6，IFN-为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-+，Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。