动物传染病实验课教案.docx

动物传染病实验课教案.docx

《动物传染病实验课教案.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物传染病实验课教案.docx（16页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

动物传染病实验课教案

实验一病料的取材和送检

目的1•学会被检病料的采取、保存、包装和记录方法内容和方法

（一）注意事项：

1•剖检前的检查急性死亡，镜检末梢血中是否有炭疽菌存在；须排除炭疽；疑为炭疽禁止剖

检。

2.器械的消毒，操作应注意无菌。

3.合理取材

（1）首先了解该传染病的流行情况、临床症状、病理解剖检查。

（2）针对性，采集合适的样本进行检验/全面取材，即根据不同的传染病，相应地采取该病常

侵害的脏器或内容物，如败血性一心、肝、脾、肺、肾、淋巴结等；肠毒血症一肠内容物；神经症状一脑；无法估计一全面采集。

（3）微生物学检查，

所采样本应未经抗菌素治疗者。

4.取材时间越早越好，一般V4~6h。

5.顺序接种培养t采样t剖检t病理。

6.作好个人防护与环境消毒。

（二）病料的采取

1.组织、脏器：

供病理切片2X2cm

2.血液、血清：

供血清学反应可加入5%石炭酸1~2滴；全血采集应加入抗凝剂。

3.脓汁、创伤感染样品

4.鼻咽分泌物

5.粪便

6.胃肠内容物

（三）病料的保存

1.细菌检验病料_30%甘油缓冲盐水；

2.病毒检验病料_50%甘油缓冲盐水；

3.

1:

10；24h后换液一次。

病理组织学材料_10%福尔马林溶液,

（四）病料的运输

1.标号（样本、包装），记录，附病料送检单（一式两份）：

详见教材pag21。

2.包装容器密封、冷藏/不冷藏

试验二免疫接种

目的：

1.掌握免疫接种的方法、步骤

2.熟悉兽医生物制品的保存、运输、用前检查方法

内容及方法

（1）生物制品的用前检查外包装：

瓶签、密封性等；

生物制品的用前检查

（1）购买专业化知名疫苗生产厂具有正式批准文号的疫苗。

（2）购买时应检查外包装、制品名称、产地、生产厂名、批号、有效期、物理性状、贮存条件等是否与说明书相符。

如有瓶子裂纹、胶塞松动、油乳剂破乳、色泽及其它物理性状与说明书不符者不得使用。

生物制品的保存、运输

（）严格按照说明书的要求进行运输、贮存和保管，特别是要求低温保存的冻干苗应更加注意原则：

低温、干燥

灭活苗、免疫血清等应保存在2~15C，防止冻结；

弱毒苗应置于0C以下，冻结保存。

免疫前注意：

（1）根据实验室监测情况，制定免疫程序，决定免疫时间。

（2）免疫接种只针对健康畜群。

（3）接种前后应减少应激反应，弱毒菌苗前后各10天不得用抗生素和含抗生素类药物的饲料;免疫病毒活苗前后各7天不能用抗病毒药物，但可在饮水或饲料中添加抗生素、维生素等抗应激的物质。

（4）免疫当天禁止对畜禽舍消毒。

（5）搞好器械消毒。

最好用高温、蒸煮等方法消毒，不要用化学消毒剂消毒针头、注射器及其它直接接触疫苗的容器。

（6）用前检查：

疫苗说明书与瓶签是否相符，检查物理性状、贮存条件等，如有瓶子裂纹、胶塞松动、油乳剂破乳、色泽及其它物理性状与说明书不符者不得使用。

（7）使用专用稀释液或清洁、不含氯等任何消毒剂的生理盐水、蒸馏水、凉开水或深井水进行稀释，

（8）禁用金属容器，器皿应清洁，无洗涤剂和消毒剂残留

接种方法及步骤

方法：

1.饮水

2•滴眼滴鼻

3.肌肉或皮下注射

4.气雾免疫

5.翼膜刺种

6.擦肛

1饮水免疫

关于饮水免疫的优缺点：

A减少应激，节省人力；但疫苗损失较多。

B雏鸡的强弱或密度会造成饮水不匀，免疫程度不齐。

饮水免疫注意：

（1）接种前24h饮水中不能加入消毒剂。

禁用金属容器，器皿应清洁，无洗涤剂和消毒剂残留。

（2）用清洁、不含氯等消毒剂和铁离子的凉开水、深井水；加1~2%脱脂奶或加入5克/L脱脂奶粉以延缓疫苗效价的衰减时间。

（3）免疫前停水2~4h,以确保2/3的鸡同时饮水。

（4）确保疫苗在1~2h内用完。

（5）通常疫苗使用量比瓶签标注量应至少增加一倍。

2、滴眼、滴鼻免疫

雏鸡早期接种弱毒疫苗常用此法。

该方法的优点体现在：

局部免疫和体液免疫共存。

滴鼻时为了使疫苗很好地吸入，可用手将对侧的鼻孔堵住，让鸡吸进去。

滴眼时，握住鸡的头部，面朝上,将一滴疫苗滴入面朝上一侧的眼皮内，不能让其流掉。

一只一只免疫，防止漏免。

3、肌肉或皮下注射

免疫效果准确，但有费力和产生应激等缺点。

（1）健康鸡群先注，弱鸡最后注射。

（2）肌肉注射以翅膀靠肩部、胸部肌肉为好。

（3）颈部皮下注射，远离头部。

4、气雾免疫在短时间内，可使大量鸡吸入疫苗获得免疫。

多用于加强免疫，本法为刺激呼吸道粘膜，所以避免在初次免疫时使用。

对于有鸡毒支原体感染/患其他慢性呼吸道病的鸡场可导致严重不良反应，应慎用。

气雾免疫注意

（1）用量按鸡舍设计和饲养量计算并适当增加（通常加倍），稀释液每1000只平养鸡用量为

200~400毫升，用适当粒度（30~50口）的喷雾器在鸡群上离鸡0.5m处喷雾。

让鸡充分吸入空气中带疫苗病毒的雾滴。

（2）免疫前应关闭门窗和通风系统，喷雾结束后至少保持30分钟然后再通风，以取得良好的

免疫效果。

5、刺种免疫

接种针应在翼膜无血管处穿刺，病毒在穿刺部位的皮肤处增殖产生免疫。

对于各种方法的免疫后应注意

（1）剩余药液及疫苗瓶应进行消毒做无害化处理，不可乱扔，以免散毒污染环境。

（2）一般5—7天（油苗10—15天）才产生抗体，故应严格控制环境卫生，以免在产生免疫力前感染强毒导致免疫失败。

（3）注意观察鸡群反应情况，出现异常及早采取措施。

（4）做详细记录，登记疫苗批号、使用日期、使用量等，并保留同批样品两瓶，出现不良反应及时处理，查找原因。

实验三炭疽实验室诊断

目的：

1掌握炭疽实验室诊断的方法步骤。

实验材料：

显微镜、载玻片、剪刀、镊子、瑞氏染液、普通琼脂平板、接种环、酒精灯、恒温培养箱、炭

疽沉淀素、炭疽标准抗原、生理盐水、平皿、试管、乳头滴管、水浴锅/电炉

实验动物及样本：

送检病料/接种炭疽无毒芽孢弱毒疫苗的小白鼠

实验内容：

1.形态学诊断：

（1）取病畜濒死或刚死亡动物的血液/组织T涂片（触片）

（2）用瑞氏染色法染色※

⑶镜检

注：

瑞氏（Wright）染色法

a涂/触片t自然干燥

b瑞氏染液染1min加等量pH6.4磷酸盐缓冲液t晃动玻片t混匀t静止5min水洗t吸干t镜

检

2.培养检查

无菌取材t接种普通培养基T37C,18~24hT观察菌落

3.Ascoli试验

a.取沉淀反应管3支t各加o.1ml炭疽沉淀素血清。

b•将待检抗原t沿管壁轻轻加入其中一支，使其重叠在炭疽沉淀素血清上，使上下两液间有一整

齐界面。

c.另二支沉淀反应管，其中一支加炭疽标准抗原；另一支加生理盐水，作为对照，方法同上。

d.将反应管直立静置，3-5min内判定结果。

实验四布氏杆菌病的检疫

目的：

1.掌握布氏杆菌病的血清学检疫方法

2.熟悉布氏杆菌病的血清学诊断的操作方法和结果的观察、判定

原理：

颗粒性抗原（细菌等）与相应的抗体混合后，在电解质的参与下经过一定时间，抗原抗体凝集成肉眼可见的凝集块，这种现象称为凝集反应。

直接凝集反应可分为玻片凝集与试管凝集。

（一）平板凝集反应

材料与试剂

1.玻璃板、刻度吸管

2.布氏杆菌凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、待检血清、生理盐水。

实验方法：

1.取一洁净玻片，用蜡笔划成方格，编号

2.各方格分别加待检血清0.08、0.04、0.02、0.01Im

3.对照：

阳性-阳性血清；阴性-阴性血清

4.用牙签混匀，摊开直径1cm左右

5.将凝集抗原摇匀，垂直滴一滴

（0.03ml）于

F各格血清上

编号

待检

1

待检

2

待检

3

待检

4

阳性对照

阴性对照

待检血清ml

0.08

0.04

0.02

0.01

0.03

阳性血清

0.03

阴性血清

标准抗原ml

0.03

0.03

0.03

0.03

0.03

0.03

6.静置3-4分，再拿起玻板轻轻转动，按下列标准记录反应结果：

++++出现大的凝集块，液体完全清亮透明，即100%凝集

+++有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即75%

++可以看见颗粒，液体不甚透明，即50%凝集

+仅仅可以看见颗粒，但液体混浊，即25%凝集

-液体均匀混浊，无凝集现象

7.结果判定：

（二）试管凝集反应

材料与试剂

1.试管、试管架、刻度吸管、恒温箱

2.布氏杆菌凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、布氏杆菌待检血清、生理盐水。

实验方法

1.每份血清用4支试管，别取对照管3支，共7支。

2•稀释血清和加入抗原的方法如下：

各管按下表所示加入0.5%石炭酸生理盐水，后加0.2ml被检血清至第1管中，混匀，吸出

1.5ml弃去，再吸0.5ml至第2管，混匀，吸0.5ml至第3管，依次至第4管，混匀，吸弃0.5ml，第5管中不加待测血清，第6管中加1:

25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5ml，第7管中加1:

25稀释的阴性血清0.5ml。

管号I

3.各管加入抗原后，七管同时混匀，37C4~10h，取出后室温18~24h，观察并记录结果

4.确定血清凝集价时，应该出现++以上凝集现象的最高稀释度为准。

24小时后观察结果

++++出现大的凝集块沉于管底，液体完全清亮透明，即100%凝集

+++有明显凝集片和颗粒沉于管底，液体几乎完全透明，即75%

++可以看见颗粒沉于管底，液体不甚透明，即50%凝集

+仅仅可以看见颗粒，液体混浊，即25%凝集

-液体均匀混浊，无凝集现象判定标准：

牛、马和骆驼凝集价1:

100以上；猪、山羊、绵羊和狗1:

50以为上阳性。

牛、马和骆驼1:

50;猪、羊等1:

25为可疑。

实验五鸡新城疫的免疫监测

目的：

1•掌握鸡新城疫血清学诊断和免疫监测的方法

2.了解鸡新城疫血清学诊断免疫监测的判定标准血凝试验（AI）和血凝抑制试验（HI）

—3微量法

实验原理

HA

新城疫病毒纤突上含有血凝素，能不同程度地凝集某些动物的红细胞

HI

新城疫病毒+红细胞t红细胞凝集

新城疫病毒+抗体t抗原抗体复合物+红细胞t红细胞不凝集

材料与试剂

1.V型血凝板、加液枪、刻度吸管

2.新城疫抗原、阳性血清、阴性血清、待检血清、生理盐水、1%的红细胞。

HA

方法：

（一）血凝试验（HA）:

取96孔板，按以下步骤操作：

1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照；

2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul,各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1〜2-12。

3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。

4、室温静置10-30分，观察结果。

5、结果判定：

红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒

最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。

结果判定：

以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。

由于新城疫病毒含有神经氨酸酶，它能破坏红细胞表面的血凝素受体，使凝集的病毒从红细胞上解脱下来，所以要及时观察结果。

HI

方法

（二）血凝抑制试验（HI）:

取一96孔板，按以下步骤操作：

1、4个单位抗原的制备：

按HA试验测出的病毒血凝价乘4即为4个单位血凝素的稀释度。

2、待检血清的稀释：

第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul

待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔…,依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释度为2-1~2-12。

3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；

4、室温静置20min;

5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。

6、室温静置10-30分，观察结果；

结果判定

以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制（HI）滴度。

鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。

鸡群HI滴度的高低在一定

程度上反映了免疫保护水平的高低。

HI滴度在1:

24的鸡群保护率约为50%;在1:

24以下的

非免疫鸡群约为10%，免疫鸡群约为40%；HI滴度在1:

26~10的鸡群保护率达90%以上。

若鸡群出现1：

211或以上的HI滴度，说明鸡群已发生新城疫野毒的感染。

实验六鸡传染性法氏囊病的抗体检测

目的：

熟悉和掌握鸡传染性法氏囊病抗体检测诊断方法。

原理：

可溶性抗原和抗体的可以在琼脂凝胶中扩散，当抗原、抗体相遇时发生特异性结合，在最适处

发生沉淀，此沉淀物因颗粒较大而不扩散，形成肉眼可见的白色沉淀带。

材料与试剂

普通琼脂平板、打孔器、针头、加样枪、枪头、V型血凝板、玻璃板、生理盐水

鸡法氏囊阳性血清、法氏囊标准抗原、待检卵黄抗体/血清

方法

1.琼脂板的制备：

1g优质琼脂溶于含0.1%石炭酸的8%氯化钠溶液100ml。

用时倒在平皿内或置于玻片上，琼脂厚度2.5~3mm。

2.打孔：

用打孔器在琼脂平板上打孔，中央1个孔，周围6个孔，形成梅花形图案。

要求：

孔径4mm，孔距3mm。

3.挑出孔内琼脂。

4.封底：

在火焰上缓缓加热，使孔底的琼脂略熔化封底，避免加样后液体从孔底渗漏。

5.卵黄液进行倍比稀释。

V型板先在第一排每孔加生理盐水50卩I,再在第一孔加50卩l的卵黄液，反复吹吸3次后，吸50卩I混和液加入第2孔，吹吸混匀，依次倍比稀释至第4孔……最后一孔吸50卩I弃去，这样1至4孔的抗体稀释倍数依次为1:

2、1:

4、1:

8和1:

16……。

6加样：

在中心孔加法氏囊标准抗原约50卩I。

第1孔加法氏囊标准阴性血清；第2孔加法氏囊标准

阳性血清。

3、4、5、6孔分别加原液、1:

2、1:

4、1:

8、1:

16……的待检卵黄液。

每孔以加满为度。

7.加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，在37C下自由扩散24-48小时。

结果判定：

若待检血清与抗原孔之间出现白色沉淀线，则表示阳性，若不出现沉淀线，为阴性。

若用于检测血清效价，则以出现沉淀线的血清最高稀释倍数表示（2n）。

用于两种抗原比较时，沉淀线有多种情形，应具体分析。

注意事项

1.做好标记，防止顺序混乱。

2.挑剔琼脂时注意不要挑破琼脂边缘。

3.加样时，注意不要产生气泡，以加满为度。

否则影响反应结果。

实验七鸡马立克氏病的血清学诊断

一、MD诊断依据

MD是高度接触传染性的，在商业鸡群中几乎是无所不在，但在感染鸡中仅有一小部分发

生MD，此外，接种疫苗的鸡虽然能得到保护不发生MD，但仍能感染MD强毒，因此是否感

染MDV不能作为诊断MD的标准。

主要依据临诊症状和病理变化。

血清学和病毒学方法可用于鸡群感染情况的监测，但不能

作为发生MD的诊断依据。

二、鸡群MDV感染情况的监测

一般采用琼脂扩散的血清学方法，检测鸡血清中的MD特异抗体或鸡羽髓中的MD抗原。

目的：

1熟悉鸡马立克氏病的诊断方法

原理：

可溶性抗原与相应抗体结合（在半固体琼脂中）后，在适量电解质存在下，经过一定时间形

成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。

材料与试剂

8%NaCI琼脂平板、打孔器、针头、加样枪、枪头、生理盐水马立克标准阳性血清、马立克标准琼扩抗原、待检羽髓

操作方法

（1）打孔：

用打孔器对琼脂平板打孔，中央打1个孔周围再打6个孔（孔径4mm,孔距3mm），形成梅花形图案。

⑵用针头挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。

⑶封底：

在火焰上缓缓加热，微微烫即可。

使孔底边缘的琼脂少许熔化以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。

⑷加样：

在中央孔加MD阳性血清，向周边1、4孔加标准MD琼扩抗原，2、3、45孔加待检羽髓浸液（加数滴生理盐水在EP管内挤压，浸泡）。

6孔加生理盐水每孔约加50卩I，以加满为度。

⑸加完后，盖上平皿盖，置湿盘中，在37C下自由扩散24小时。

结果判定

被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原的沉淀线互相融合者，判为阳性；不出现沉淀线的判为阴性。

注意事项

1）在平皿上贴好标签，防止弄混。

2）挑琼脂时注意不要挑破琼脂边缘。

3）一定要封底。

4）加样时，注意不要产生气泡，以加满为度，否则影响反应结果。

5）每加完不同的样后要更换枪头，以免造成污染。

实验八传染病的实验室诊断

一、细菌性传染病的诊断

1病料的采集和处理：

避免杂菌污染、不同期不同标本、用抗菌素以前、标本必须新鲜、运

送注意保存的问题。

1）有病灶：

采集病变明显部位

2）没有病灶：

不同期不同标本；不同系统疾病不同侧重点，如：

常侵害的脏器或内容物。

2、病原菌的检查程序1）直接涂片t镜检。

［初步诊断］

2）细菌分离f据不同的目的选择不同的培养基（亮绿、伊红-美兰、血红素马丁纯培养。

3）生化试验

4）血清学试验：

凝集试验、沉淀试验、中和试验、补体结合试验……

双份血清标本，恢复期血清中抗体效价比急性期血清中抗体效价升高》4倍者方有意义

5）动物试验

6）药敏试验

［明确诊断］

3、分子生物学技术4、其他检测技术

二、病毒性传染病的诊断

病料的采集和处理：

考虑V嗜器官性、含毒量1病毒分离、培养：

鸡胚、细胞培养

2、血清学检查：

AGP、HI※（需阳性血清）

4倍者方有意义

血清学检查：

+/-;滴度

双份血清标本，恢复期血清中抗体效价比急性期血清中抗体效价升高》