动物传染病实验课教案.docx

1、动物传染病实验课教案实验一病料的取材和送检目的1学会被检病料的采取、保存、包装和记录方法 内容和方法（一） 注意事项：1剖检前的检查 急性死亡，镜检末梢血中是否有炭疽菌存在；须排除炭疽；疑为炭疽禁止剖检。2.器械的消毒，操作应注意无菌。3.合理取材（1 ）首先了解该传染病的流行情况、临床症状、病理解剖检查。（2）针对性，采集合适的样本进行检验 /全面取材，即根据不同的传染病，相应地采取该病常侵害的脏器或内容物，如败血性一心、肝、脾、肺、肾、淋巴结等；肠毒血症一肠内容物；神 经症状一脑；无法估计一全面采集。（3 ）微生物学检查，所采样本应未经抗菌素治疗者。4.取材时间 越早越好，一般V 46h。

2、5. 顺序 接种培养t采样t剖检t病理。6.作好个人防护与环境消毒。（二） 病料的采取1.组织、脏器：供病理切片 2X 2cm2.血液、血清：供血清学反应可加入 5%石炭酸12滴；全血采集应加入抗凝剂。3.脓汁、创伤感染样品4.鼻咽分泌物5.粪便6.胃肠内容物（三）病料的保存1.细菌检验病料_30%甘油缓冲盐水；2.病毒检验病料_50%甘油缓冲盐水；3.1:10 ； 24h后换液一次。病理组织学材料_10%福尔马林溶液,（四）病料的运输1. 标号（样本、包装），记录，附病料送检单（一式两份）：详见教材pag21。2.包装容器密封、冷藏/不冷藏试验二 免疫接种目的：1.掌握免疫接种的方法、步骤2

3、.熟悉兽医生物制品的保存、运输、用前检查方法内容及方法(1)生物制品的用前检查 外包装：瓶签、密封性等；生物制品的用前检查(1)购买专业化知名疫苗生产厂具有正式批准文号的疫苗。(2)购买时应检查外包装、制品名称、产地、生产厂名、批号、有效期、物理性状、贮存条件 等是否与说明书相符。如有瓶子裂纹、胶塞松动、油乳剂破乳、色泽及其它物理性状与说明书 不符者不得使用。生物制品的保存、运输()严格按照说明书的要求进行运输、贮存和保管，特别是要求低温保存的冻干苗应更加注意 原则：低温、干燥灭活苗、免疫血清等应保存在 215C，防止冻结；弱毒苗应置于0C以下，冻结保存。免疫前注意：(1)根据实验室监测情况，

4、制定免疫程序，决定免疫时间。(2)免疫接种只针对健康畜群。(3) 接种前后应减少应激反应， 弱毒菌苗前后各10天不得用抗生素和含抗生素类药物的饲料; 免疫病毒活苗前后各 7天不能用抗病毒药物，但可在饮水或饲料中添加抗生素、维生素等抗应 激的物质。(4 )免疫当天禁止对畜禽舍消毒。(5)搞好器械消毒。最好用高温、蒸煮等方法消毒，不要用化学消毒剂消毒针头、注射器及其 它直接接触疫苗的容器。(6)用前检查：疫苗说明书与瓶签是否相符，检查物理性状、贮存条件等，如有瓶子裂纹、胶塞松动、油 乳剂破乳、色泽及其它物理性状与说明书不符者不得使用。(7 )使用专用稀释液或清洁、不含氯等任何消毒剂的生理盐水、蒸馏

5、水、凉开水或深井水进行 稀释，(8)禁用金属容器，器皿应清洁，无洗涤剂和消毒剂残留接种方法及步骤方法：1.饮水2滴眼滴鼻3.肌肉或皮下注射4.气雾免疫5.翼膜刺种6.擦肛1饮水免疫关于饮水免疫的优缺点：A减少应激，节省人力；但疫苗损失较多。B雏鸡的强弱或密度会造成饮水不匀，免疫程度不齐。饮水免疫注意：(1)接种前24h饮水中不能加入消毒剂。 禁用金属容器，器皿应清洁，无洗涤剂和消毒剂残留。(2) 用清洁、不含氯等消毒剂和铁离子的凉开水、深井水；加 12 %脱脂奶或加入 5克/L脱脂 奶粉以延缓疫苗效价的衰减时间。(3)免疫前停水2 4 h,以确保2 /3的鸡同时饮水。(4)确保疫苗在1 2 h

6、内用完。(5)通常疫苗使用量比瓶签标注量应至少增加一倍。2、 滴眼、滴鼻免疫雏鸡早期接种弱毒疫苗常用此法。该方法的优点体现在：局部免疫和体液免疫共存。滴鼻时 为了使疫苗很好地吸入， 可用手将对侧的鼻孔堵住， 让鸡吸进去。滴眼时，握住鸡的头部，面朝上, 将一滴疫苗滴入面朝上一侧的眼皮内，不能让其流掉。一只一只免疫，防止漏免。3、 肌肉或皮下注射免疫效果准确，但有费力和产生应激等缺点。(1)健康鸡群先注，弱鸡最后注射。(2 )肌肉注射以翅膀靠肩部、胸部肌肉为好。(3)颈部皮下注射，远离头部。4、气雾免疫 在短时间内，可使大量鸡吸入疫苗获得免疫。多用于加强免疫，本法为刺激呼吸道粘膜，所以避免在初次免

7、疫时使用。对于有鸡毒支原体感 染/患其他慢性呼吸道病的鸡场可导致严重不良反应，应慎用。气雾免疫注意(1)用量按鸡舍设计和饲养量计算并适当增加(通常加倍) ，稀释液每1000只平养鸡用量为200400毫升，用适当粒度(3050 口)的喷雾器在鸡群上离鸡 0.5m处喷雾。让鸡充分吸入空 气中带疫苗病毒的雾滴。(2 )免疫前应关闭门窗和通风系统，喷雾结束后至少保持 30分钟然后再通风，以取得良好的免疫效果。5、刺种免疫接种针应在翼膜无血管处穿刺，病毒在穿刺部位的皮肤处增殖产生免疫。对于各种方法的免疫后应注意(1 )剩余药液及疫苗瓶应进行消毒做无害化处理，不可乱扔，以免散毒污染环境。(2) 一般5 7

8、天(油苗1015天)才产生抗体，故应严格控制环境卫生，以免在产生免疫力 前感染强毒导致免疫失败。(3 )注意观察鸡群反应情况，出现异常及早采取措施。(4)做详细记录，登记疫苗批号、使用日期、使用量等，并保留同批样品两瓶，出现不良反应 及时处理，查找原因。实验三炭疽实验室诊断目的：1掌握炭疽实验室诊断的方法步骤。实验材料：显微镜、载玻片、剪刀、镊子、瑞氏染液、普通琼脂平板、接种环、酒精灯、恒温培养箱、炭疽沉淀素、炭疽标准抗原、生理盐水、平皿、试管、乳头滴管、水浴锅 /电炉实验动物及样本：送检病料/接种炭疽无毒芽孢弱毒疫苗的小白鼠实验内容：1.形态学诊断：(1)取病畜濒死或刚死亡动物的血液 /组织

9、T涂片(触片)(2)用瑞氏染色法染色镜检注：瑞氏(Wright)染色法a涂/触片t自然干燥b瑞氏染液染1min加等量pH6.4磷酸盐缓冲液t晃动玻片t混匀t静止 5 min水洗t吸干t镜检2.培养检查无菌取材t接种普通培养基T 37C ,1824hT观察菌落3.Ascoli 试验a.取沉淀反应管3支t各加o.1ml炭疽沉淀素血清。b将待检抗原t沿管壁轻轻加入其中一支 ，使其重叠在炭疽沉淀素血清上，使上下两液间有一整齐界面。c.另二支沉淀反应管，其中一支加炭疽标准抗原 ；另一支加生理盐水，作为对照，方法同上。d.将反应管直立静置，3-5min内判定结果。实验四布氏杆菌病的检疫目的：1.掌握布氏杆

10、菌病的血清学检疫方法2.熟悉布氏杆菌病的血清学诊断的操作方法和结果的观察、判定原理：颗粒性抗原（细菌等）与相应的抗体混合后，在电解质的参与下经过一定时间，抗原抗体 凝集成肉眼可见的凝集块，这种现象称为凝集反应。直接凝集反应可分为玻片凝集与试管凝集。（一）平板凝集反应材料与试剂1.玻璃板、刻度吸管2.布氏杆菌凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、待检血清、生理盐水。实验方法：1.取一洁净玻片，用蜡笔划成方格，编号2.各方格分别加待检血清 0.08、0.04、0.02、0.01 Im3.对照：阳性-阳性血清；阴性-阴性血清4.用牙签混匀，摊开直径 1cm左右5.将凝集抗原摇匀，垂直

11、滴一滴(0.03ml ) 于F各格血清上编号待检1待检2待检3待检4阳性对照阴性对照待检血清ml0.080.040.020.010.03阳性血清0.03阴性血清标准抗原ml0.030.030.030.030.030.036.静置3-4分，再拿起玻板轻轻转动，按下列标准记录反应结果：+出现大的凝集块，液体完全清亮透明，即 100%凝集+ 有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即 75%+可以看见颗粒，液体不甚透明，即 50%凝集+ 仅仅可以看见颗粒，但液体混浊，即 25%凝集- 液体均匀混浊，无凝集现象7.结果判定：（二）试管凝集反应材料与试剂1.试管、试管架、刻度吸管、恒温箱2.布氏杆菌凝集抗

12、原、布氏杆菌标准阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、布氏杆菌待检血清、 生理盐水。实验方法1.每份血清用4支试管，别取对照管 3支，共7支。2稀释血清和加入抗原的方法如下：各管按下表所示加入 0.5%石炭酸生理盐水，后加 0.2ml被检血清至第1管中，混匀，吸出1.5ml弃去，再吸0.5ml至第2管，混匀，吸0.5ml至第3管，依次至第4管，混匀，吸弃0.5ml， 第5管中不加待测血清，第 6管中加1:25稀释的布氏杆菌阳性血清 0.5ml，第7管中加1:25稀 释的阴性血清0.5ml。管号I3.各管加入抗原后，七管同时混匀， 37 C 410h，取出后室温1824h，观察并记录结果4.确定血清凝

13、集价时，应该出现 +以上凝集现象的最高稀释度为准。24小时后观察结果+出现大的凝集块沉于管底，液体完全清亮透明，即 100%凝集+ 有明显凝集片和颗粒沉于管底，液体几乎 完全透明，即75%+ 可以看见颗粒沉于管底，液体不甚透明，即 50%凝集+ 仅仅可以看见颗粒，液体混浊，即 25%凝集- 液体均匀混浊，无凝集现象 判定标准：牛、马和骆驼凝集价 1: 100以上；猪、山 羊、绵羊和狗1: 50以为上阳性。牛、马和骆驼1 : 50;猪、羊等1 : 25为可疑。实验五鸡新城疫的免疫监测目的：1掌握鸡新城疫血清学诊断和免疫监测的方法2.了解鸡新城疫血清学诊断免疫监测的判定标准 血凝试验（AI ）和血

14、凝抑制试验（HI）3微量法实验原理HA新城疫病毒纤突上含有血凝素，能不同程度地凝集某些动物的红细胞HI新城疫病毒+红细胞t红细胞凝集新城疫病毒+抗体t抗原抗体复合物+红细胞t红细胞不凝集材料与试剂1.V型血凝板、加液枪、刻度吸管2.新城疫抗原、阳性血清、阴性血清、待检血清、生理盐水、 1%的红细胞。HA方法：（一）血凝试验（HA）:取96孔板，按以下步骤操作：1、 第一排1-12孔各加生理盐水 50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照；2、 吸50ul病毒液于第一排第 1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第 12孔，弃去50ul, 各孔经倍比稀释后稀释度依次为 2-12-

15、12。3、 第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡 2min混匀。4、 室温静置10-30分，观察结果。5、 结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即 HI效价，用2n表示。结果判定：以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。由于新城疫病毒含有神经氨酸酶，它能破坏红细胞表面的血凝素受体，使凝集的病毒从红细胞 上解脱下来，所以要及时观察结果。HI方法（二）血凝抑制试验（HI）:取一 96孔板，按以下步骤操作：1、 4个单位抗原的制备：按 HA试验测出的病毒血凝价乘 4即为4个单位

16、血凝素的稀释度。2、 待检血清的稀释：第一、二、三排 1-12孔各加生理盐水 50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔,依次稀释至第 12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释度为 2-12-12。3、 第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡 2min混匀；4、 室温静置20min ;5、 第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡 2min混匀混匀。6、室温静置10-30分，观察结果；结果判定以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制（ HI）滴度。鸡群HI滴度

17、的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。鸡群 HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。 HI滴度在1 : 24的鸡群保护率约为 50% ;在1 : 24以下的非免疫鸡群约为10%，免疫鸡群约为 40% ； HI滴度在1 : 2610的鸡群保护率达 90%以上。若 鸡群出现1： 211或以上的HI滴度，说明鸡群已发生新城疫野毒的感染。实验六鸡传染性法氏囊病的抗体检测目的：熟悉和掌握鸡传染性法氏囊病抗体检测诊断方法。原理：可溶性抗原和抗体的可以在琼脂凝胶中扩散，当抗原、抗体相遇时发生特异性结合，在最适处发生沉淀，此沉淀物因颗粒较大而不扩散，形成肉眼可见的白色沉淀带。材料与试剂普通琼

18、脂平板、打孔器、针头、加样枪、枪头、 V型血凝板、玻璃板、生理盐水鸡法氏囊阳性血清、法氏囊标准抗原、待检卵黄抗体 /血清方法1.琼脂板的制备：1g优质琼脂溶于含 0.1%石炭酸的8%氯化钠溶液100ml。用时倒在平皿内或置于玻片上，琼脂 厚度 2.53mm。2.打孔：用打孔器在琼脂平板上打孔，中央 1个孔，周围6个孔，形成梅花形图案。要求：孔径4mm，孔距3mm。3.挑出孔内琼脂。4.封底：在火焰上缓缓加热，使孔底的琼脂略熔化封底，避免加样后液体从孔底渗漏。5.卵黄液进行倍比稀释。V型板先在第一排每孔加生理盐水 50卩I,再在第一孔加 50卩l的卵黄液，反复吹吸3次后，吸 50卩I混和液加入第

19、2孔，吹吸混匀，依次倍比稀释至第 4孔最后一孔吸50卩I弃去，这样 1至4孔的抗体稀释倍数依次为 1:2、1:4、1:8和1:16。6加样：在中心孔加法氏囊标准抗原约 50卩I。第1孔加法氏囊标准阴性血清； 第2孔加法氏囊标准阳性血清。3、4、5、6孔分别加原液、1:2、1:4、1:8、1:16的待检卵黄液。每孔以加满为 度。7.加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，在 37C下自由扩散24-48小时。结果判定：若待检血清与抗原孔之间出现白色沉淀线，则表示阳性，若不出现沉淀线，为阴性。若用于检测血清效价，则以出现沉淀线的血清最高稀释倍数表示（ 2n）。用于两种抗原比较时，沉淀线有多种情形

20、，应具体分析。注意事项1.做好标记，防止顺序混乱。2.挑剔琼脂时注意不要挑破琼脂边缘。3.加样时，注意不要产生气泡，以加满为度。否则影响反应结果。实验七鸡马立克氏病的血清学诊断一、 MD诊断依据MD是高度接触传染性的，在商业鸡群中几乎是无所不在，但在感染鸡中仅有一小部分发生MD，此外，接种疫苗的鸡虽然能得到保护不发生 MD，但仍能感染 MD强毒，因此是否感染MDV不能作为诊断 MD的标准。主要依据临诊症状和病理变化。血清学和病毒学方法可用于鸡群感染情况的监测，但不能作为发生MD的诊断依据。二、 鸡群MDV感染情况的监测一般采用琼脂扩散的血清学方法，检测鸡血清中的 MD特异抗体或鸡羽髓中的 MD

21、抗原。目的：1熟悉鸡马立克氏病的诊断方法原理：可溶性抗原与相应抗体结合（在半固体琼脂中）后 ，在适量电解质存在下，经过一定时间形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。材料与试剂8%NaCI琼脂平板、打孔器、针头、加样枪、枪头、生理盐水 马立克标准阳性血清、马立克标准琼扩抗原、待检羽髓操作方法（1）打孔：用打孔器对琼脂平板打孔，中央打 1个孔周围再打6个孔（孔径4mm,孔距3mm）， 形成梅花形图案。用针头挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。封底：在火焰上缓缓加热，微微烫即可。使孔底边缘的琼脂少许熔化以封底，以免加样后液 体从孔底渗漏。加样：在中央孔加 MD阳性血清，向周边1、4孔加标准MD琼扩抗原，2

22、、3、4 5孔加待检 羽髓浸液（加数滴生理盐水在 EP管内挤压，浸泡）。6孔加生理盐水每孔约加 50卩I，以加满为 度。加完后，盖上平皿盖，置湿盘中，在 37C下自由扩散24小时。结果判定被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原的沉淀线互相融合者，判为阳 性；不出现沉淀线的判为阴性。注意事项1） 在平皿上贴好标签，防止弄混。2） 挑琼脂时注意不要挑破琼脂边缘。3） 一定要封底。4） 加样时，注意不要产生气泡，以加满为度，否则影响反应结果。5） 每加完不同的样后要更换枪头，以免造成污染。实验八 传染病的实验室诊断一、细菌性传染病的诊断1病料的采集和处理 ：避免杂菌污染、不同期不同

23、标本、用抗菌素以前、标本必须新鲜、运送注意保存的问题。1） 有病灶：采集病变明显部位2） 没有病灶：不同期不同标本；不同系统疾病不同侧重点，如：常侵害的脏器或内容物。2、病原菌的检查程序 1）直接涂片t镜检。初步诊断2） 细菌分离f据不同的目的选择不同的培养基（亮绿、伊红 -美兰、血红素马丁纯培养。3） 生化试验4） 血清学试验：凝集试验、沉淀试验、中和试验、补体结合试验双份血清标本，恢复期血清中抗体效价比急性期血清中抗体效价升高 4倍者方有意义5） 动物试验6） 药敏试验明确诊断3、分子生物学技术 4、其他检测技术二、病毒性传染病的诊断病料的采集和处理：考虑 V嗜器官性、含毒量 1病毒分离、培养：鸡胚、细胞培养2、血清学检查：AGP、HI （需阳性血清）4倍者方有意义血清学检查：+/-;滴度双份血清标本，恢复期血清中抗体效价比急性期血清中抗体效价升高