备考浙大博士分子生物学复习题.docx

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备考浙大博士分子生物学复习题

一、胰岛素的信号转导途径

胰岛素（包括IGFI、IGFII）信号所激发的信号传递途径主要有二,一为Ras-MAPK途径，一为PI3-激酶途径。

（一）Ras-MAPK途径　当胰岛素或IGF与胰岛素受体结合后，引起受体自身磷酸化而活化（酪氨酸激酶的活性），活化的受体使胞质内的胰岛素受体底物（IRS）IRS-1和SHc等的酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基结合Grb2的SH2结构域，Grb2的SH3结构域又可与Sos结合并使之活化，激活的Sos即可与质膜上的Ras相结合。

Sos具有鸟苷酸交换因子（GEF）的作用，使Ras释放结合的GDP，结合GTP而活化。

Ras的下游信息传递是一系列蛋白激酶的级联传递和放大过程。

活化的Ras-GTP与Raf的N端结构域结合并使之活化，Raf是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（MAPKKK），活化Raf结合并激活另一种蛋白激酶MAPKK，它可结合并磷酸化有丝分裂原活化蛋白激酶MAPK（mitogen－activatedproteinkinase，MAPK）的第185位酪氨酸残基及第183位苏氨酸残基，而使之激活。

活化的MAPK进入细胞核，可使EIK-1、RNA聚合酶II等许多转录因子活化，进而促进c-fos，c-jun的表达。

Ras-MAPK信号通路可概括如下：

配体→RPTK→adaptor（如Grb2）→GEF→Ras→Raf（MAPKKK）→MAPKK

→MAPK→进入细胞核→转录因子→基因表达。

通过Ras-MAPK传递途径可促使靶细胞基因表达，导致细胞生长、增殖及分化。

（二）磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）途径　PI3-K的SH2结构域能与含磷酸酪氨酸残基的信号分子如IRS-1结合，SH3结构域能与富含脯氨酸的各种信号蛋白结合。

当胰岛素或IGF作用于胰岛素受体后,PI3-K与酪氨酸磷酸化的IRS-1结合，激活催化活性，PI3-K的靶蛋白是蛋白激酶B（PKB）。

PKB是Ser/Thr蛋白激酶家族的成员,。

当胰岛素及IGF作用于靶细胞时迅速引起PKB的活化，并使PKB从细胞膜脱落，进入胞质，进而对胞质内的靶蛋白发挥作用。

PKB的靶蛋白有：

磷酸果糖激酶-2，与糖酵解的调控有关；糖原合成激酶3（glycogensynthasekinase3，GSK3）；受PKB磷酸化后GSK3活性降低，再使糖原合成酶因磷酸化减少而活性增加，从而导致糖原合成增加。

此外,GSK3与mRNA转录起动的活化也有关。

参与细胞凋亡的Bad蛋白也是PKB的底物，PKB使Bad磷酸化而转变成无活性形式，从而抑制细胞凋亡。

此外,PKB还与葡萄糖的转运、细胞增殖、分化及细胞周期的调节等有关。

二、JAK-STAT信号转导途径

JAK（justanotherkinase或januskinase）是一类非受体酪氨酸激酶家族，已发现四个成员，即JAK1、JAK2、JAK3和TYK1，其结构不含SH2、SH3，C段具有两个相连的激酶区。

JAK的底物为STAT，即信号转导子和转录激活子（signaltransducerandactivatoroftranscription，STAT），具有SH2和SH3两类结构域。

STAT被JAK磷酸化后发生二聚化，然后穿过核膜进入核内调节相关基因的表达，这条信号通路称为JAK-STAT途径

JAK-STAT途径

1、配体与受体结合导致受体二聚化；

2、二聚化受体激活JAK；

3、JAK将STAT磷酸化；

4、STAT形成二聚体，暴露出入核信号；

5、STAT进入核内，调节基因表达。

RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP）限制性片段长度多态性，当用限制性内切酶切割不同品种或个体的基因组DNA时，如果限制性内切酶的酶切位点的碱基发生突变，或者酶切位点之间DNA片段发生碱基的插入或缺失，导致酶切片断的大小、数量发生了变化，产生相当多的数目和大小不等的DNA片段。

这种变化可以通过特定的探针杂交进行检测，从而可以比较不同品种或个体之间的DNA水平的差异（或多态性）。

广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物的进化和分类关系研究。

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphismDNA,RAPD）随机扩增多态性DNA，利用随即引物扩增寻找多态性DNA片段的分子标记方法。

是建立在PCR技术基础上，利用一系列（通常数百）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（一般为10bp）为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，然后用凝胶电泳分开扩增片段，EB等染色剂染色后检测扩增产物DNA片段的多态性。

与RAPD技术相类似的还有AP-PCR（ArbitraryPrimedPCR）和DAF（DNAAmplifiedFingerprints）2种标记技术。

在AP-PCR分析中，所使用的引物较长（通常10～50bp），扩增分为3个部分，每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异。

DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是它使用引物浓度更高，长度更短（一般5～8bp），只有2个温度循环，并常用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所提供谱带信息比RAPD大得多。

AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP）扩增片段长度多态性，AFLP是RFLP和PCR结合的产物，其基本原理是：

将基因组DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增，使用双链人工"接头"与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应模板，"接头"与"接头"相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。

这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性片段被扩增，再在高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物。

该技术的独特之处在于所用的专用引物可在不知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。

是目前一种十分理想有效的分子标记

STS（Sequence-TaggedSite,STS）序列标签位点是基因组上定位明确、作为界标并能通过PCR扩增被唯一操作的短的、单拷贝DNA序列，，用于产生作图位点，即测定一系列STS的次序即可作出基因组区域的图谱。

STS主要包括简单重复序列（SimpleSequenceRepeatPolymorphisms,简称SSR或SSRP）、锚定简单重复序列（AnchoredSimpleSequenceRepeats,ASSR）、序列特异扩增区域（Sequence-characterizedamplifiedregions）、酶切扩增多态性序列（CleavedAmplifiedPolymorphismSequences,CAPS）、单引物扩增反应（SinglePrimerAmplificationReaction,SPAR）等标记技术。

SSR（Simple　Sequence　Repeats，SSR）简单重复序列真核生物的基因组中散布大量的串联重复序列，其中2～4个bp的微卫星序列具有高度多态性，微卫星在结构上的最大特点是两端序列较保守，因此可设计与两端保守序列互补的引物进行PCE扩增，来揭示微卫星的多态性。

SSR是检测多态性的一种有效方法。

SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism,SSCP）单链构像多态性是指相同长度的单链DNA因核苷酸序列的差异，甚至单个碱基不同，而产生的构像变异，在非变性聚丙烯酰胺中表现为电泳迁移率的差别。

PCR产物变性处理，双链DNA分开成单链，再用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。

SSCP分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。

SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性，达到指纹分析的目的。

该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。

SNP（SingleNucleotidePolymorphism,SNP）单核苷酸多态性是指DNA序列上单个核苷酸的差异，是单个核苷酸置换产生的遗传标记。

根据从STS中确定SNP位点的经验，每千个核苷酸会出现一个标记位点，因SNP的分布密集。

检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术，如果能将所有SNP全部信息载入DNA芯片，就可制造基因组扫描仪，用来扫描各个个体并分析它们在基因组成上的差异。

SCAR（Sequence-characterizedamplifiedregions）SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的。

目标RAPD片段克隆和测序，根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物进行PCR特异扩增。

EST（expressedsequencetag，EST）表达序列标签短的、单次（测序）阅读的cDNA5’或3‘端序列。

也包括来自于差异显示和RACE实验的cDNA序列。

一般是来自不同组织来源的cDNA序列，长度在300-500bp左右。

Contig重叠群或邻接片段基因组测序中将许多序列片段经过比对找到重叠区，从而连接成长片段，这些片断称重叠连续群，简称重叠群。

UniGene—被整理成簇的EST和全长mRNA序列，每一个代表一种特定已知的或假设的人类基因，有定位图和表达信息以及同其它资源的交叉参考。

SAGE（serialanalysisofgeneexpression,），基因表达系列分析是近几年来发展起来的一种快速分析基因表达水平信息的技术。

它通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息。

基因组学（Genomics），指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。

基因组研究应该包括两方面的内容：

以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学，又被称为后基因组（postgenome）研究。

蛋白质组（proteome）指全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，是一个基因、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分，蛋白质组学是不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。

蛋白质组学（protemics）。

蛋白质组学是不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。

它从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式，功能机理、调节控制、药物开发、新陈代谢途径等提供理论依据和基础。

功能基因组学（Functuional　genomics）又称为后基因组学（Postgenomics），它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质得研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。

RNAi和反义RNA

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）引发的转录后基因静默机制。

RNAi的机制可能是双链RNA进入细胞后，在Dicer酶的作用下，被切割成21-23bp大小的小分子干扰RNA片段（smallinterferingRNAs，siRNAs），siRNAs结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。

激活的RISC可以精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。

生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。

这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。

由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统。

研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directedRNApolymerase，RdRP）。

在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。

双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。

SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。

结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。

这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。

从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。

反义RNA（antisenseRNA）是一种本身缺乏编码能力,但能与特异靶RNA（主要是mRNA）互补的RNA分子,它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物,抑制靶RNA的功能,从而调控基因的正常表达。

反义RNA技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA,通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA,然后转染受体细胞,则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA,对基因的表达进行调控,从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。

选择具有明显的生物学效应的靶序列后,反义RNA即通过和相应的RNA互补而达到阻断其功能的目的。

YAC（yeastartificialchromosome，YAC）

一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列。

BAC（BacterialArtificalChromosome，BAC）

BAC系统是基于大肠杆菌中可大容量容纳基因且稳定性良好的F因子衍生而来的载体系统，可容纳超过100kb的插入片段，BAC克隆的插入片段的平均长度为120kb，最大可达到240kb左右。

良好的稳定性和操作的简便性是BAC系统的主要优点。

PAC（P1bacteriophageartificialcromosome，PAC）

PAC系统是以噬菌体P1为基础的克隆系统，它可容纳70～100kb的插入片段，并可选择性地区分重组子和非重组子，且同时有两套复制机制。

单拷贝复制子可用于稳定克隆增殖，而多拷贝复制子则可在Lac操纵子的控制下用于DNA的制备。

CAP分解代谢活化蛋白，是原核E.coli细胞内作用最强的基因调节物之一，是控制营养代谢有关的一套操纵子的激活蛋白。

CAP通过结合cAMP而形成活化的CAP－cAMP复合物，能结合到操纵子的启动子上或附近的特异CAP结合位点，帮助RNA聚合酶有效的结合到启动子上，提高形成封闭起始复合物的速度，从而提高了转录效率。

CAP的作用位点在它调控的各种操纵子中都处于离开转录起始位点不同的距离。

物理图谱是DNA片段上限制性内切酶酶切位点的图谱，表示各种限制性内切酶识别位点在DNA序列上的线性排列。

DNA一级结构的差异往往反映出物理图谱的不同。

因此物理图谱是分子结构特征的反映，也是研究分子克隆不可缺少的条件。

遗传图谱通过遗传重组所得到的基因线性排列图称为遗传连锁图。

它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩（cM，即每次减数分裂的重组频率为1%）来表示。

绘制遗传连锁图的方法有很多，早期RFLP、RAPD、AFLP、；80年代后出现的有STR、和90、SNP、。

转录图谱利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱被称为转录图谱

CG岛基因组DNA中大部分CG二核苷酸对是高度甲基化的，但在仍有一簇簇稳定的非甲基化的CG小片段，称为CG岛，通常长度越1～2kbp，平均相距100kbp。

特点是G＋C含量高，大多数CG岛缺乏甲基化。

大约70％的CG岛与持家基因偶联，其他的出现在组织特异性基因内。

CG岛还常常易于同转录机构的蛋白质因子相互作用。

阐述PCR的原理和方法P82

阐述cDNA文库的构建方法P54

阐述基因组文库的构建方法P58

阐述什么是基因突变？

并说明产生基因突变有哪些途径？

阐述DNA修复系统

DNA修复（DNArepairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而能继续生存。

原核和真核生物对于DNA的损伤都有很多的修复系统，如SOS系统。

对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。

（一）回复修复　这是较简单的修复方式，一般都能将DNA修复到原样。

1.光修复　这是最早发现的DNA修复方式。

修复是由细菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300－600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。

后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。

2.单链断裂的重接　DNA单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由DNA连接酶（ligase）参与而完全修复。

此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。

但双链断裂几乎不能修复。

3.碱基的直接插入　DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶（insertase）识别结合，在K＋存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使DNA完全恢复。

4.烷基的转移　在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。

这个酶的修复能力并不很强，但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。

（二）切除修复（excisionrepair）　是修复DNA损伤最为普遍的方式，对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。

这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。

修复过程需要多种酶的一系列作用，基本步骤如图16?

1所示，①首先由核酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5′侧切开磷酸二酯键。

不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。

②由5′→3′核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。

③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5′→3′方向DNA链，填补已切除的空隙。

④由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。

这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。

（三）重组修复（recombinationalrepair）

上述的切除修复在切除损伤段落后是以原来正确的互补链为模板来合成新的段落而做到修复的。

但在某些情况下没有互补链可以直接利用，例如在DNA复制进行时发生DNA损伤，此时DNA两条链已经分开，其修复可用图16?

2所示的DNA重组方式：

①受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。

②另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口。

③以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。

重组修复不能完全去除损伤，损伤的DNA段落仍然保留在亲代DNA链上，只是重组修复后合成的DNA分子是不带有损伤的，但经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。

（四）SOS修复

“SOS”是国际上通用的紧急呼救信号。

SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（errorpronerepair），使细胞有较高的突变率。

当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺，再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶SOS修复酶类，催化空缺部位DNA的合成，这时补上去的核苷酸几乎是随机的，但仍然保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。

但这种修复带给细胞很高的突变率。