分子生物学实验论文.docx

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分子生物学实验论文

小鼠β-actin基因的克隆

【摘要】β-actin基因是肌动蛋白的一种，在各种细胞和组织当中，β-actin基因表达相对稳定【1】，且β-actin基因在核DNA中有多个拷贝，增加了核DNA的检测率【2】，在PCR当中常常被作为内参使用。

本次实验通过对从小鼠肝脏中提取得到的RNA进行PT-PCR、扩增、克隆、筛选以及PCR鉴定和酶切鉴定等，获得纯度较好的β-actin基因，为以后的实验打下了基础。

【Abstract】β-actingeneisakindofactin，Inallsortsofcellsandtissues，β-actingeneexpressrelativelystable【1】，andβ-actingenesinnuclearDNAhasmultiplecopies，increasednuclearDNAdetectionrate【2】，sothatitisoftenusedasthereferenceinPCR。

ThisexperimentbymakingPT-PCR,amplification,clone,filter,andPCRidentificationandendonucleaseidentification,etc.ofRNA,whichisextractedfromtheliversofthemice,getsthegoodpurityofβ-actingenes,laythefoundationofthelaterexperiment.

【关键词】RT-PCR，克隆，酶切

目录

1、前言…………………………………………………..2

2、实验仪器、试剂与材料……………………………..3

2.1实验仪器…………………………………………………..3

2.2试剂与材料………………………………………………...3

3、方法与结果分析……………………………………..4

3.1小鼠肝脏总RNA提取……………………………………4

3.1.1实验步骤……………………………………………………4

3.2RT－PCR、扩增产物纯化与琼脂糖凝胶电泳鉴定…5

3.2.1实验步骤…………………………………………………….5

3.2.2结果分析.....................................................................................5

3.3RT-PCR产物克隆……………………………………………….6

3.3.1实验步骤………………………………………………………6

3.3.2结果分析.......................................................................................6

3.4转化子的筛选及PCR鉴定………………………………….8

3.4.1实验步骤………………………………………………………8

3.4.2结果分析........................................................................................9

3.5重组质粒提取与酶切鉴定………………………………………..10

3.5.1实验步骤……………………………………………………….10

3.5.2结果分析........................................................................................11

4、结论..........................................12

参考文献.........................................13

1、前言

β-actin在不同长生条件和不同生长阶段稳定表达，因而常作为一种内参基因被广泛使用，对于β-actin基因的研究也有很多的实验【3】，然而纸上得来终觉浅，觉知此事要鞠行，正所谓实践出真知，通过这次小鼠β-actin基因的克隆的实验，我们不仅了解到了β-actin基因的作用，同时实验操作能力大大增强，更重要的是，我们获得了独立思考的能力和懂得了团队合作精神的重要性。

这正是我们开展大实验的初衷。

2、实验仪器、试剂与材料

2.1实验仪器:

低温高速离心机（AnkeTGL-16B，上海安亭科学仪器厂），组织研磨棒，DEPC水处理的EP管与枪头，移液器（0.5-10微升、10-200微升，100-1000微升的量程），一次性手套，眼科剪，眼科镊，止血钳，PCR仪（2720ThermalCycler，ABAppliedBiosystems）；恒温水浴箱（HWS26型电热恒温水浴箱，上海一恒科技有限公司，上海一恒科学仪器有限公司），微波炉（WG700TL20Ⅱ-K6,佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司），电泳仪（DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂），紫外分析仪（北京市六一仪器厂）；净化超净台（SW-CJ-IF，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），冰盒，培养箱（MODEL，SGSP-02，黄石市恒丰医疗器械有限公司），摇床（气浴恒温振荡器，SHZ-82A，金坛市宏华仪器厂），玻璃试管，离心机，玻璃棒；涂布器，灭菌试管。

2.2试剂与材料：

小鼠，Trizd试剂，氯仿（三氯甲烷CHCL3,,天津市富宇精细化工有限公司），异丙酮[（CH3）2CHOH,江苏强盛化工有限公司出品，上海润捷化学试剂有限公司总代理]，75﹪乙醇（DEPC处理的水配制），无水乙醇[（CH3）2CHOH,江苏强盛化工有限公司出品，上海润捷化学试剂有限公司总代理]，5×RTBuffer，dNTPMixture，RNaseInhibitor，AMVReverseTranscriptase，OligodT-AdaptorPrimer；MgCl2、10×RTBuffer、RNaseFreeH2O、dNTPMixture、RNaseInhibitor、AMVReverseTranscriptase、OligodT-AdaptorPrimer、5×PCRBuffer、dH2O、dNTPMixture、TaKaRaExTaqHS、上下游PCR引物（10pmol/L）、凝胶回收试剂盒、TAEBuffer、电泳上样缓冲液、EB、DNAMarker；pMD19-T载体试剂盒，0.1MCaCl2，菌株与培养基【大肠杆菌DH5α；LB（Amp-）培养基，含X-gal和IPTG的LB（Amp+）平板】；LB（含Amp）液体培养基，PCRBuffer、dNTPmix、Primer1#、Primer2#、TaqDNApolymerase、H2O、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、上样缓冲液、DNA染料；含质粒DNA的过夜培养的DH5α菌株LB菌液1.5mL，溶液Ⅰ【50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）】，溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH，1%SDS），溶液Ⅲ【（乙酸钾溶液）：

5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，定容至100mL,并高压灭菌，溶液终浓度为:

K+3mol/L,Acˉ5mol/L】，异丙醇、无水乙醇、70％乙醇，酶切鉴定试剂（限制性内切酶酶切所需试剂：

质粒DNA、EcoRI、HindIII和酶切反应缓冲液，琼脂糖凝胶电泳所需试剂：

1％的琼脂糖凝胶，TAE电泳缓冲液，10×加样缓冲液，DNA染料。

3、方法与结果分析

3.1小鼠肝脏总RNA提取

3.1.1实验步骤

3.1.1.1解剖小鼠，取其肝脏，分成六份，取一份放入已含500ulTrizol的DEPC处理过的1.5mlEP管中；

3.1.1.2快速研磨，再加500mlTrizol研磨，室温5min使其充分溶解；

3.1.1.312000rpm离心5min，将上清转移至一新的DEPC处理后的1.5mLEP中，加入200μL氯仿，振荡混匀，室温放置3min；

3.1.1.412000rpm离心15min；

3.1.1.5离心后混合物分为三层：

下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。

RNA无一例外地存在于水样层当中。

小心移取上层无色水样层，转移至另一新EP管中；

3.1.1.6加入500μL异丙醇，室温放置15min；

3.1.1.712000rpm离心15min，这时会在EP管的底部看到白色沉淀；轻轻弃去上清；

3.1.1.8加入1mL75％乙醇（用DEPC处理的水配制）洗涤RNA沉淀；

3.1.1.97500rpm离心5min,弃上清；将EP管倒置，干燥，挥发剩余的乙醇；

3.1.1.10用20ulDEPC处理的水溶解RNA沉淀。

3.2RT－PCR、扩增产物纯化与琼脂糖凝胶电泳鉴定

3.2.1实验步骤

3.2.1.1RT－PCR：

配好并混匀反转录反应液（5×RTBuffer2μL+dNTPMixture4μL+RNaseInhibitor0.5μL+AMVReverseTranscriptase1μL+OligodT-AdaptorPrimer0.5μL+实验样品RNA2μL），然后进行反转录反应（42℃30min、99℃5min、5℃5min）；

3.2.1.2PCR反应：

配好并混匀PCR反应液（10×PCRBuffer5μL+ddH2O28ul+dNTPMixture4μL+TaKaRaTaqHS1μL+上游PCR引物1ul+下游PCR引物1ul），然后进行PCR反应【94℃2min、（94℃30sec、61.5℃30sec、72℃1.5min）×30Cycle、72℃7min、4℃】；

3.2.1.3琼脂糖凝胶电泳：

称1g琼脂糖+100mlTAE缓冲液，微波炉加热2分钟熔化后取出，待其冷却到手可以忍受的温度时加入5ulEB混匀，然后倒入装好的胶槽内（一块大胶两块小胶）。

胶凝固后大胶上样（50ul样品+10ulLoading

Buffer，混匀，因觉得加50ul梳子孔装不下，后来就只加了40ul，剩下的加到第二个孔）。

电泳（109mA），指示剂跑到胶的一半时停止；

3.2.1.4扩增产物的纯化：

将胶拍照后拿到紫外灯下观察，切取所需DNA条带于1.5mlEP管中+200ulBindingBuffer（xp2）59.9℃水浴熔化。

将熔胶液转移至套在一个2mL收集管的HiBindDNAMini柱子中10000转离心1min。

弃滤液，+300ulBindingBuffer（xp2）10000转离心1min。

弃滤液，+700ulSPWWashBuffer10000转离心1min，重复一次。

弃滤液，13000转离心2min。

将柱子装到一个新EP管中，+20ulElutionBuffer13000转离心1min洗脱DNA,重复一次。

3.2.1.5跑电泳（小胶）：

5ul样品+1ulLoading

Buffer，128mA电泳，因跑得太慢，中途改为143mA、103v。

电泳结束拿胶去拍照。

3.2.2结果分析

3.2.2.1

图一PCR扩增产物的凝胶电泳图

首先加的是marker，左边标的数字对应表示marker的分子量。

其余两孔上的样是RT-PCR扩增后的样品，可见每个孔道显示有两条条带，上面那条小的条带表示的是扩增后的DNA，分子量为1.2kb，与marker的分子量对比相差不大，比较准确；下面大的条带表示的是PCR扩增后留下来的引物等杂质。

50ul样品+10ulLoading

Buffer配好上样液，隔孔加，本来每孔上样50ul，但一开始有的组加了50ul的样品溢了出来，后来就改为加40ul，我们组1孔加40ul，剩下的上样液就全部加到2孔了。

可见这两个孔的DNA条带都很浅，由于荧光强度与DNA含量成正比，所以证明我们的样品中所含DNA量较少，可能是因为我们操作不够严谨，致使部分RNA被RNA酶降解了；或者PCR过程反应不充分，因为我们在PCR管上贴了标签，这会影响PCR的温度，使反应不能准确充分地进行；又可能是因为我们分开加的量太少，这些因素都会影响DNA的含量。

3.2.2.2

图二扩增产物纯化后的凝胶电泳图

这是纯化后的显示条带，对比图一，可见DNA含量条带基本相同，证明纯化效果较好，同时进一步鉴定了该条带确实表示的是DNA的含量，达到预期理想的效果。

3.3RT-PCR产物克隆

3.3.1实验步骤

3.3.1.1PCR产物与T载体的连接：

用0.2ml的PCR管做实验组（ddH2O2μL+SolutionⅠ5μL+pMD19-T载体1μL+PCR产物2μL）和对照组（ddH2O3μL+SolutionⅠ5μL+pMD19-T载体1μL+ControlInsert1μL），轻混，16℃连接反应30min以上。

3.3.1.2大肠杆菌感受态细胞的制备：

接种10μL甘油菌至含有2ml培养基（Amp-）的试管中，37℃振荡培养过夜。

以1%的接种量将甘油菌种30μL接种到3mlLB培养基（Amp-）中，37℃振荡培养3h（此时菌液的A600值达到0.3～0.4）。

室温下，以5000rpm离心2min，回收细胞。

在超净工作台里用枪头吸取上清弃掉，再用100μL预冷的0.1MCaCl2溶液重悬菌体（重悬时操作要轻），冰浴放置。

3.3.1.3大肠杆菌的转化（无菌操作）：

将连接产物（试验组和对照组）加入到制备好的感受态细胞里，用加样枪反复吹打，将质粒与感受态细胞混合均匀，冰浴10min；42℃水浴热休克2min，时间到后迅速在冰上冷却10min；加入1mLLB培养基（Amp-），37℃静置半小时；5000rpm离心2min，在超净工作台中用枪头吸取800μL上清弃掉，用剩余的液体将细胞悬浮；将悬浮细胞全部吸取并转移至含X-gal和IPTG的LB（Amp+）平板上，用无菌玻璃棒涂布均匀，37℃倒置培养过夜。

3.4转化子的筛选及PCR鉴定

3.4.1实验步骤

3.4.1.1蓝白斑平板的制作：

于1L烧杯中加入：

Tryptone10g、YeastExtract5g和NaCl10g，加入约800mL的去离子水，充分搅拌混匀。

滴加5NNaOH（约0.2mL）,调节PH值至7.0。

加去离子水将培养基定容至1L后，加入15gAgar。

高温高压灭菌后，冷却至60度左右。

加入1mLAmpicillin（100mg/mL）、1mLIPTG（24mg/mL）、2mLX-Gal（20mg/mL）后均匀混合。

铺制平板（30-35mL培养基/90mm培养皿）。

4度避光保存,一般存放24小时后才开始使用。

次日从37度温箱中取出平板观察，蓝色菌落即初步认定为未转化菌，白色菌落初步认定为转化子。

3.4.1.2菌落PCR：

按顺序在配PCR反应体系（10XPCRBuffer2μL+dNTPmix1.6μL+Primer1#1ul+Primer2#1μL+TaqDNApolymerase0.5μL+ddH2O13.9μL），常温下随机挑选一个转化板上的转化子，用灭菌的小枪头挑取少量菌体；先将小枪头放入一支装有约3mLLB（Amp+）培养基的试管中洗涤2-3次，然后将同一枪头浸入装有PCRmixture的PCR管中反复吹打以作扩增培养细菌用，做两管；另取一PCR管，先进行操作

（2）的操作，但不加转化子模板，作为阴性对照。

将以上两个PCR管轻微离心后，放入PCR仪中反应【94℃5min、（94℃30sec、61.5℃30sec、72℃1.5min）×30Cycle、72℃7min、4℃】。

取少量10μLPCR反应产物，1%琼脂糖电泳分析。

紫外检测仪下观察并记录扩增片段大小。

注意：

电泳时需有标准DNA分子量Marker和不加模板的阴性对照样品。

上述操作

（2）中的洗涤过有菌枪头的试管，空气摇床37℃,180-200rpm过夜（12-14hr）扩增培养，以备后续实验质粒提取及酶切使用。

3.4.2结果分析

图三蓝白斑平板菌落图

观察蓝白斑平板可以看到平板上有许多的菌落被克隆长出来，菌落布满整个平板，表明我们的平板涂布得很均匀；同时大部分菌落是白色的（转化子），只有少量甚至没有是蓝色菌（未转化菌），说明我们在转化这一步做得很成功；但是下午再观察的时候，发现蓝色菌好像又长了一些，可能因为菌落长得慢，同时也有可能是是因为放在桌面上暴露于空气中污染影响所导致，这些差别表明我们上午挑菌的实验可能会有些少的错误，例如挑到了蓝色的未转化的但是还没有显示出蓝色的菌落，而拿这些菌落去培养的话，会造成实验结果的失败。

图四转化子PCR反应产物的凝胶电泳图

第1、2孔加的是PCR反应产物，可见第1孔效果较为理想，第2孔条带颜色稍浅，可能是挑取菌落的枪头在LB培养基的试管中洗涤次数过多，以致枪头再放到PCR管中吹打时此时剩下的菌落已经很少了；亦有可能是在平板上挑取的菌落的时候挑到的菌落太少，反而把较多的琼脂挑了进来，稀释了溶液中DNA的浓度，因而DNA含量低，条带显示较淡。

当然，第一孔太亮的话也有可能是因为挑的菌落太多，引起基因的非特异性扩增。

重组子PCR后之所以只显示1.2kb而不是3.9kb条带，是因为引物只是特异的扩增目的基因【4】。

3.5重组质粒提取与酶切鉴定

3.5.1实验步骤

3.5.1.1重组质粒提取：

取1.5mL培养液分两次倒入1.5mLEP管中，12000r/min离心1分钟，弃上清，将管倒置于吸水纸上数分钟，使液体流尽。

加入100μL溶液Ⅰ，用枪头充分重悬菌体沉淀。

加入新配制的溶液Ⅱ200μL,盖紧管口，立即轻柔上下颠倒4-5次。

（3min左右，别超过5min）加入150μL溶液Ⅲ，盖紧管口，上下颠倒EP管5-10次。

12000r/min离心5分钟。

用黄枪头小心将上清转移到一新EP管中（分别得400ml、400ml和430ml），再加入等体积酚氯仿（下层），混匀。

12000r/min离心2分钟。

将上清移至一新EP管中（分别得350ml、250ml和400ml），加入两倍体积的无水乙醇，12000r/min离心5分钟，弃上清。

加入1mL70％的乙醇，用枪头轻轻吹打洗涤沉淀，注意不要将沉淀打碎或吸走。

12000r/min离心5分钟，小心用弃去上清，注意不要将沉淀倒走。

将EP管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。

用20μL含RNaseA的无菌蒸馏水溶解提取物，室温放置，充分溶解DNA。

3.5.1.2酶切鉴定：

在EP管内配酶切反应体系（质粒DNA10μL+10×酶切反应缓冲液2μL+EcoRI1μL+HindIII1μL+无菌蒸馏水6μL）。

离心混匀，37℃水浴反应3－4小时。

制备1％的琼脂糖凝胶板。

取酶切后全部DNA样品10ul加入上样缓冲液2ul混匀。

上样进行琼脂糖凝胶电泳（131mA，103U）。

3.5.1.3电泳胶拍照，紫外监测仪观察

3.5.2结果分析

图五质粒酶切鉴定图

该电泳图中第1、2、3孔分别是没有酶切的样品5-1、5-2、5-3，第4、5、6孔分别是酶切以后的样品5-1’、5-2’、5-3’，最左边的是marker及其各条带分子量大小。

由图可知，没有酶切的第1孔和对应的有酶切的第4孔电泳之后都没有条带显示，分析原因得知，最大可能是由于第1管即5-1是最早做的，可能因为时间太长了而导致DNA被降解，不过也有可能是溶液Ⅱ量少使DNA释放不出来或者溶液Ⅲ没有很好的中和前面的碱性溶液而使得质粒的DNA复性变得不可溶。

重组子的分子量大小未3.9kb，其中质粒的是2.7kb，目的基因的是1.2kb。

然而没有经过酶切的2、3孔都同时显示出了3.9kb和2.7kb的条带出来，这进一步证明了在电泳之前已经有部分目的基因被降解了。

第2、3孔道的条带的位置有偏差，则与质粒DNA的构象有关，质粒DNA的存在形式有三种：

①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；

线性DNA,因质粒的两条链在同一处断裂而造成。

质粒DNA的三种形式泳动速度：

超螺旋﹥线性﹥开环。

因而出现了同一物质条带在泳道上的位置偏差。

再看第5孔道，经过酶切以后的，很好的分离出了2.7kb和1.2kb的条带，而且没有3.9kb的条带出现，说明这是一个很好的完全切除；而第6孔道的现象与第2、3孔道差不多，显然是受第2孔道部分目的基因降解的影响，但第6孔道的3.9kb带又明显比第2孔道的亮，同时考虑到第5孔的没有出现3.9kb的条带，这充分说明了第2、3孔的样品是在酶切反应的时间里被就降解的。

当然，影响酶切效果的因素有很多，除了酶反应条件外，最主要的是DNA的纯度。

例如，样品中含有大量的RNA杂质、某些杂蛋白未除净而结合在DNA上，都会影响酶切效果。

至于提取过程中未除净的各种影响因素就更多了，例如微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或者琼脂糖凝胶之中的硫酸根离子等。

【5】

4、结论

这次实验最后结果显示我们组克隆的小鼠β-actin基因与质粒的重组子大部分没有切除和不完全切除，得不到比较理想的结果，说明我们的实验操作能力和团队合作精神尚有待加强，警示我们在实验过程中更要注意一些细节和时间的控制。

不过所幸，我们还是有一孔的条带清楚显示了质粒与目的基因的完全切除，证明我们的能力还是有的，缺乏的只是实践能力，只要多动手，相信我们以后会做得更好。

总的来说，第一次做此类大实验，我们有这样的成绩，还是值得鼓励的。

参考文献

【1】周国燕，陈唯实，冉姝，等，用DSC测定小鼠看家基因β-actin的PCR反应体系的比热，上海理工大学食品与低温生物技术研究所，食品科学-生物工程348第10期，2007，vol.28.

【2】袁正杰，张改生，孙瑞，等，内参法在线粒体DNA纯度鉴定中的应用，麦类作物学报，2009，29（6）：

1088-1093.

【3】杨爱馥，周遵春，董颖，等，仿刺参cytb和β-actin基因表达稳定性比较，中国农业科技导报，2010.12

（1）;79-84.

【4】http：

∥XX百科

【5】